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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,显微技术,马玉堃,野生动物资源学院,2009,年,3,月,第六节 透射电子显微镜成像原理,透射电子显微镜是利用透过样品的透射电子成像的。电子枪发射出电子射线，经聚光镜后照射在样品上，电子束和样品相互作用后，经透镜成像、放大，在终屏上形成带有样品信息的图像。经某种方式处理，为我们眼睛所识别。那均匀的电子束是如何和样品作用，变成带有样品信息的成像电子的呢,?,一、成像过程,在光学显微镜和电子显微镜中，有四种基本的物理过程参与成像：吸收、散射、干涉和衍射。,1,吸收,光学显微镜成像主要是吸收作用，样品中不同物质的吸收有差别，从而形成图像。而在透射电镜中，样品是“薄膜”样品，吸收是很少的，而且吸收在电镜样品中也是不允许的。因为吸收将伴随着热量释放，薄膜样品受热会烧毁的。,2,散射,在透射电镜中散射是最重要的成像机制。一个高速自由电子打在薄膜样品上后，电子将和组成样品的原子发生散射作用。原子由原子核和核外电子所组成。如果高速电子是和原子核相作用，由于原子核的质量比电子大的多，入射电子与核发生弹性碰撞，即弹性散射。入射电子不损失能量，但运动方向发生较大偏转，如图,137(a),。,当入射电子与样品中原子核外的一个电子发生碰撞时，因质量相同，相互作用之后，将重新分配能量。快速电子将一部分能量交给核外电子，改变速度大小，同时运动方向也发生改变，产生非弹性散射。此时散射角比弹性散射角度小得多，如图,l37(b),。,散射的强弱可以用“原子散射截面”来表示，它是一个电子穿透单位面积的样品时，受到一个原子散射的几率，用,表示。弹性散射截面可表示为：,表示，电子受重原子（,Z,大）弹性散射的可能性大，而快速电子受弹性散射的可能性小。,非弹性散射截面可表示为：,和,Z,的关系不如弹性散射显著，两者和,Z,的关系为：,即：电子受重元素比轻元素弹性散射的可能性大。,一个光点发出一束电子，样品是很薄的，如果只有一层原子，我们知道，原子核和电子的大小是,10,-5,-10,-6,A,的数量级，而原子间距是,1A,或更大些。所以，样品本身对于入射电子来说几乎是完全空的空间。大量的入射电子是直接穿过足够薄的样品，打在荧光屏上，形成一亮的背景。只有那些十分接近样品中原子核和核外电子的入射电子才会发生散射，运动轨道发生偏转。散射角越大，电子在物镜后焦面上离轴越远。当散射角大到一定程度，就会被处于物镜后焦面上的物镜光阑所截,(,图,l38),。那对应于散射能力大的样品上的一个点的像就是一个暗点。这就是由于电子散射形成的图像反差。,上面讨论的是一个入射电子与一个原子、一排电子和一层原子作用的情况。对于实际样品，入射电子在运动轨道上将和多个原子核及电子碰撞。在运动过程中，所碰到的原子数目越多，被散射的可能性越大，所以总散射量和样品的厚度成正比；同样原子核越大，被散射的可能性越大，总散射量也和物质的密度成正比。即总散射量与样品的质量和厚度的乘积成正比。我们定义质量和厚度的乘积为“质量厚度”。样品各处的质量厚度不同，在荧光屏上就形成明暗不同的黑白图像，叫做振幅反差。,质量厚度的单位是,ug,cm2,，碳的密度约为,2g,cm3,，厚度为,l00A(106cm),的碳膜质量厚度为,2ug,cm2,。生物薄切片的平均质量厚度在,l0ug,cm2,左右。,3.,干涉,从波动学说来看，一个运动的电子可以看作是一个电子波，它向着电子运动的方向以匀速的并随时间作正弦变化的方式前进。可以把电子和样品的作用，看做电子波经过样品后形成了透射波和散射波。如果物镜光阑让透射波和散射波同时通过，入射电子波又是相干的，则电镜中的像就是这两部分波受透镜场作用并相互干涉后合成的结果。当样品很薄时，散射波相对入射波振幅基本不变而相位有变化。由于物质的原子和电子结构没有两个入射电子在穿过薄样品时具有完全相同的路径，即各电子和样品作用的散射波和透射波的相位差不同，各相位差为,的奇数倍时，两者合成波为极小者；为,的偶数倍时，合成波为极大者。使合成波,(,干涉波,),与透射波在振幅上表现出差别，在最终的像中就会出现亮暗不同的区域，这种反差叫做相位反差。透镜的球差和失焦也会引起相位反差。,相位反差人眼看不到，通过改变物镜聚焦状态，即改变合成波的位相，将相位反差转换为振幅反差为人眼所看。,综上，透射电镜图像的反差由振幅反差和相位反差两部分组成。,(1),振幅反差,：由样品的各部分质量厚度不同引起的透射中的电子波强度,(,振幅,),变化所提供。它是在物镜后焦面处用小光阑只让一部分,(,透射束或散射束,),通过，从而形成振幅反差像。对于样品结构细节大小超过,10-15A,，样品厚度大于,l00A,的样品反差，主要由振幅反差提供。,(2),相位反差,：入射电子是相干的，它们受到样品的散射而产生的相位差，而成像系统的球差和失焦也引起附加的相位差，这两者的叠加效应引起的反差叫做相位反差。它是在物镜后焦面处用较大的光阑,(,甚至不用光阑,),让两束或多束电子通过，它们相互干涉并重新合成相位像。对于微细结构,d10A,，厚度小于,l00A,的样品成像，相位反差是主要的。对于低原子序数的小结构样品，相位反差几乎成了唯一的反差来源。,4,衍射,由于衍射效应，形成,Airy,盘或条纹，虽然可以加强图像的反差，但使像的分辨率下降。,二、提高生物样品反差的方法,生物样品图像主要由振幅反差提供，下面讨论振幅反差。,反差,(Contrast),，又叫对比度、衬度，为底片上相邻两部分亮度的比。也就是样品的像与背景在亮度上的差别。它与经样品散射后，通过物镜光阑的电子数目有关。一般定义电子反差量,G,为：,式中：,N1,样品某一区域内每平方厘米的电子数目；,N2,样品另一区域内每平方厘米的电子数目。,可以证明，由质量厚度引起的反差,G,为：,其中：,NA,阿佛加德罗常数；,M,原子量；,物质密度；,t,样品厚度；,单个原子散射截面。,眼睛要看到电镜图像，图像本身必须要有一定的反差。即图像各细节之间光强度的差别，能为眼睛所识别。,由上述讨论可知，入射电子和样品发生散射作用，弹性散射的散射角大，几乎经过一次散射，多数电子都能被物镜光闹截住，对提供反差有利，而非弹性散射，一般散射角都比较小，经过散射的电子仍能通过物镜光阑。但其速度减慢，使出射电子束有色差，在图像上产生眩光，是我们所不希望的。,提高生物样品反差的方法有下列几种：,1,加人物镜光阑,从样品各物点被散射的电子如果被重新聚集在像平面上各点，那就无法区分出散射多或散射少的各物点，物像就没有反差，图像是模糊不清的。加上物镜光阑（图,1-38,），它可以拦截部分大角度散射电子，使散射强的部位变暗，就可形成振幅反差。,物镜光阑对提高反差作用显著，故又叫反差光阑。物镜光阑尽可能地接近透镜的光学中心，光阑必须非常圆，对透镜轴对中好，在亮度许可的情况下，尽量选用小光阑。物镜光阑又可限制照明孔径角，有利分辨本领的提高。,2,提高样品中某些部分的原子序数,z,由前面公式知道，电子受重原子弹性散射的可能性大，提高反差的一种方法是提高样品中一些部分的原子序数,Z,的值。而生物样品的组成元素,H,、,C,、,N,、,O,和,P,多是小原子序数，能提供的反差小。另外，生物样品大都要制成很薄的切片，才能到电镜中去观察。制片时的包埋剂又多是有机物质，和样品本身散射能力区别不大。所以生物样品在电镜下，反差是小的，提高生物样品反差是很重要的课题。可以用两种方法提高样品的,Z,值。,(1),用重金属盐来染生物样品：利用某些重金属元素，铀,(,Zu,=92),、铅,(,Zpb,=82),及锇,(,Zos,=76),等的盐类和生物样品作用，重元素或与生物样品的基些样品结构结合，或染色剂把生物样品衬托出来，以增加样品各部分对电子散射能力的差别，提高反差。这种方法叫电子染色。有正染色和负染色两种方法。,(2),重金属投影喷涂法：用金,(,ZAu,=79),、铂,(,ZPt,=78),等重金属对样品喷镀，提高散射能力，增强反差。,3,选用较低的加速电压,由公式可知，电子弹性散射截面和加速电压,V,成反比，降低加速电压可增大弹性散射，有利反差的提高。但加速电压低时，由于电子的波长长，速度低，易受杂散电磁场的干扰，对污染特别敏感。同时非弹性散射随电压下降也增加，使色差加大。这都会使分辨本领大大降低。所以低加速电压一般只用于低放大倍数。,4,暗场显微法,前面所讨论的是用直接透过样品的电子和部分散射电子，通过物镜光阑作为成像电子来成像的情况，这种方法叫亮场照明，所成的像为亮场像。暗场像则是利用样品的散射电子所成的像。该像的明暗和亮场像相反。暗场像的反差高，但强度却很低。,获得暗场像的方法有以下几种：,(1),偏心光阑法：如图,139(a),所示，把物镜光阑移到一边，使得刚好挡住笔直的主电子束。因像是由极边缘的散射电子束形成的，则像差大，分辨本领低。,(2),倾斜电子束照明法：如图,l39(b),所示。电子束以一倾斜角入射，使笔直的主电子束被物镜光阑挡住，只有散射电子束参与成像。这种方法的优点是散射电子束对称地进入成像系统，且色差减少到最小。现在许多电镜中都专门装有电子束倾斜装置。,(3),中心束阻挡光阑法：如图,139(c),所示。利用一个特殊的物镜光阑,中心束阻挡光阑，挡住笔直的主电子束，几乎所有的边缘散射电子都能进人成像系统，参与成像，像的亮度较大。用此法在,1000kV,超高压电镜中，可以得到较好反差的生物样品的图像，可以观察到在亮场中看不到的细节。但物镜光阑制作的不对称性，使像差较大。,(4),环形聚光镜光阑：如图,139(d),所示。这是最近发展起来的方法。在聚光镜中加一环状光阑，形成一空心锥状聚集电子束照射在样品上。选择一个大小适当的物镜光阑，使能挡住非散射电子，而只允许散射的轴上电子进人物镜光阑。这种方法对物镜光阑污染小，像散也小。,对生物样品而言，我们总是希望能获得反差高、分辨率高的样品电镜图像。要高反差，就要切片厚些。但切片厚了，一是可能电子束穿不过；二是电子穿过时，和样品原子要多次散射，色差增大；再则由于电镜有大的景深，厚切片在全部厚度上分布的细节都可以清晰成像，而在终像上这些像叠加在一起，成为混杂的不可分辨的图像。因此，要得到高分辨率，就要求切片很薄。同时考虑反差和分辨率，再加上各种提高反差技术的作用，经验表明，在常用的,50-60kV,加速电压下，生物切片最适合的厚度是,500-600A,。此时如果样品细节的反差好，并且结构不过于致密，终像可以得到,15-20A,的分辨率。要发挥现代高性能电镜的分辨本领,3A,的水平，目前水平的生物超薄切片是很难达到的，那要采用特殊的样品制备技术。,
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