ELISA试验方法的相关问题及质量控制

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,ELISA,试验方法的相关问题及质量控制,河北医科大学第二医院检验科,李永军,酶联免,疫,疫吸附,试,试验,（,enzymelinked immunosorbentassay,ELISA,),),1971年由瑞,典,典学者Engrall和Perlmann,荷兰学,者,者Vanweeman和Schuurs报道。,开创了,运,运用酶,标,标记免,疫,疫技术,进,进行液,体,体标本,中,中,微量物,质,质测定,的,的实验,方,方法。,酶免疫,技,技术的,分,分类,酶免疫,组,组化,酶免疫,技,技术,均相酶,免,免疫测,定,定,酶免疫,测,测定,液,液,相,相酶免,疫,疫测定,异相酶,免,免疫测,定,定,固相酶,免,免疫测,定,定,（ELISA）,Ag,+,+Ab*AgAb*,+,+Ab,*,*,均相法,：,：抗原抗,体,体反应,后,后AgAb*中的标,记,记物失,去,去特性,，,，,不需进,行,行AgAb*与Ab*的分离,，,，可直,接,接测,定游离,的,的Ab*量，从,而,而推算,标,标本中,的,的Ag量。,异相法,：,：抗原抗,体,体反应,后,后，需,将,将AgAb*与Ab*,，,，然后,测定AgAb*或Ab*的量，,从,从而推,算,算标本,中,中的,Ag,量。,ELISA方法的,基,基本原,理,理,（1）,使,使抗原,或,或抗体,结,结合到,固,固相载,体,体表面,，,，并保,持其免,疫,疫活性,。,。,（2）,使,使抗原,或,或抗体,与,与酶结,合,合成酶,标,标抗原,或,或抗体,，,，,并保持,抗,抗原或,抗,抗体的,免,免疫活,性,性和酶,的,的活性,。,。,（3）,酶,酶标的,抗,抗原或,抗,抗体与,相,相应的,抗,抗体或,抗,抗原反,应后，,结,结合在,免,免疫复,合,合物上,的,的酶催,化,化底物,形成水,解,解、氧,化,化或还,原,原反应,，,，形成,有,有色物,质，其,颜,颜色的,深,深浅与,标,标本中,的,的抗原,或,或抗体,的量直,接,接相关,。,ELISA方法的,基,基本类,型,型,（一）,双,双抗体,夹,夹心法,（二）,间,间接,法,法,（三）,竞,竞争,法,法,（一）,双,双抗体,夹,夹心法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗,原,原,（二）,间,间接法,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗,体,体,酶标抗,抗,抗体,（三）,竞,竞争法,洗涤,洗涤,待测抗,原,原,酶标抗,原,原,双位点,夹,夹心法,洗涤,酶标抗,B,A,B,捕获法,固相抗IgM,特异IgM,非特异IgM,标本,特异抗,原,原,抗原特,异,异酶标,抗,抗体,底物,ELISA试验的,方,方法学,原,原理,一步法,：,Ab+Ag,+,+Ab*AbAg,Ab*,(,(a),AbAg,(,(b,),),AgAb*,(,(c),Ab*-AgAb(d),二步法,AbAg,+,+Ab*AbAg,Ab*,Ab*+AgAb*Ag,(,(洗涤),ELISA方法的,影,影响因,素,素及控,制,制,表面效,应,应(Surfaceeffects),蛋白质,分,分子在,吸,吸附过,程,程中，,为,为了克,服,服与固,相,相载体,之,之间的,排,排斥力,需,需要重,新,新分布,其,其表面,的,的功能,性,性基团,，,，使疏,水,水性基,团,团充分,暴,暴露，,然,然后局,部,部接触,区,区域的,偶,偶极分,子,子脱氢,，,，再通,过,过范德,华,华引力,而,而固相,到,到载体,表,表面。,表,表面效,应,应可直,接,接影响,抗,抗原、,抗,抗体的,够,够象和,功,功能,固相导,致,致抗原,的,的变化,为了测,定,定抗体,的,的水平,，,，需预,先,先将抗,原,原（包,被,被）到,极,极性和,疏,疏水性,的,的聚苯,乙,乙烯（PS）或聚氯,乙,乙烯（PVC,）,）微板上,，,，利用,直,直接物,理,理吸附,方,方法固,相,相蛋白,质,质抗原,，,，可引,起,起分子,够,够象和,抗,抗原性,发,发生改,变,变,固相对,抗,抗体的,影,影响,将抗体,固,固相化,时,时，直,接,接吸附,法,法固相,抗,抗体分,子,子，除,了,了呈团,串,串状，,不,不均匀,分,分布，,易,易解吸,等,等外，,还,还可发,生,生构象,改,改变，,使,使抗体,结,结合价,减,减少甚,至,至失活,。,。,高剂量,钩,钩镰效,应,应(HD-HookEffects),发生在,固,固相法,试,试验过,程,程中的,，,，可造,成,成假低,值,值甚至,假,假阴性,错,错误结,果,果的特,殊,殊效应,，,，称为HD-Hook效应,。,边缘效,应,应(Edge effects,),),由于微,量,量反应,板,板周边,孔,孔与内,部,部孔升,降,降温速,率,率的差,别,别，造,成,成周边,孔,孔与内,部,部孔结,果,果的差,异,异，这,就,就是边,缘,缘效应,或,或位置,效,效应,弥散效,应,应(Diffusionlimits),在固相,法,法中抗,原,原抗体,结,结合，,底,底物与,酶,酶的接,触,触，转,换,换的信,号,号产物,向,向液体,内,内弥散,的,的过程,中,中，液,相,相与固,相,相中的,分,分子必,须,须穿过,液,液面的Nernst层，也,就,就是液,固,固屏障,，,，使反,应,应速率,受,受到限,制,制。,干扰物,质,质,类风湿,因,因子,补体,嗜异性,抗,抗体,血清粘,度,度过大,、,、血脂,过,过高,胆红素,、,、血红,蛋,蛋白,抗凝剂,（,（肝素,、,、EDTA）,酶类,类风湿,因,因子,类人血,清,清中IgM、IgG型风湿,因,因子可,以,以与ELISA系统中,的,的捕获,抗,抗体及,酶,酶标记,二,二抗的FC段直接,结合，,导,导致假,阳,阳性。,将热变,性,性IgG（63,，10分钟）,加,加入到,标,标本稀,释,释液中,。,。,用2-,巯,巯基乙,醇,醇加入,到,到标本,稀,稀释液,中,中，使RF降解。,补体,在固相,化,化和标,记,记抗体,的,的过程,中,中，抗,体,体FC段的补,体,体C1q分子结,合,合位点,被,被暴露,，,，使C1q可以将,二,二者连,接,接起来,，,，造成,假,假阳性,。,。,用EDTA稀释标,本,本。,用63,，10分钟,或,或56,，30分钟,加,加热使C1q灭活。,嗜异性,抗,抗体,人类血,清,清中含,有,有能与,齿,齿齿类,动,动物（,鼠,鼠）Ig结合的,天,天然嗜,异,异性抗,体,体，可,将,将ELISA系统中,一,一抗和,二,二抗连,接,接起来,，,，造成,假,假阳性,。,。,在标本,稀,稀释液,中,中加入,过,过量的,动,动物Ig。,标本溶,血,血,标本溶,血,血可使,红,红细胞,破,破坏溶,解,解释放,出,出大量,的,的具有,过,过氧化,物,物酶活,性,性的血,红,红蛋白,，,，从而,导,导致非,特,特异性,显,显色。,标本受,细,细菌污,染,染,菌体中,含,含有内,源,源性辣,根,根过氧,化,化物酶,，,，被细,菌,菌污染,的,的标本,，,，在以,辣,辣根过,氧,氧化物,酶,酶为标,记,记物的ELISA测定中,，,，会导,致,致非特,异,异性显,色,色。,标本保,存,存不当,在冰箱,中,中保存,过,过久的,标,标本，,血,血清中IgG可聚合,成,成多聚,体,体、AFP可形成,二,二聚体,，,，在间,接,接法ELISA测定中,会,会造成,假,假阳性,。,。,标本放,置,置时间,过,过长，,有,有时抗,原,原或抗,体,体的免,疫,疫活性,减,减弱，,亦,亦可出,现,现假阴,性,性。,5天内测,定,定的血,清,清标本,可,可存放4，1周后,测,测定的,血,血清标,本,本应低,温,温冻存,。,。,标本凝,集,集不全,在没有,促,促凝剂,和,和抗凝,剂,剂的情,况,况下，,正,正常血,液,液采集,后,后1/22,小,小时开,始,始凝固,，,，18,24小时完全,凝,凝固。,强,强行分,离,离血清,，,，血清,中,中会有,纤,纤维蛋,白,白原残,留,留，形,成,成假阳,性,性。,充分凝,固,固后分,离,离血清,；,；用带,分,分离胶,的,的采血,管,管或采,血,血管中,加,加入抗,凝,凝剂。,添加物,质,质的影,响,响,抗凝剂,（,（如肝,素,素，EDTA）、酶抑制,剂,剂,（如NaN3)、分离胶,等,等可干,扰,扰ELISA测定。,ELISA试验的,有,有关问,题,题,洗涤液,洗涤的,目,目的：除去,未,未结合,的,的免疫,反,反应物,；,；终止,抗,抗原抗,体,体的继,续,续结合,；,；除去,血,血清中,与,与反应,无,无关的,其,其它成,份,份和游,离,离的酶,结,结合物,；,；以及,在,在反应,过,过程中,非,非特异,性,性地吸,附,附于固,相,相载体,的,的干扰,物,物质。,洗涤液,的,的种类,：,：,蒸馏水,吐温-,蒸,蒸馏水,吐温-,生,生理盐,水,水,PBS,-,-吐温-,蒸,蒸馏水,Tris-吐温-,蒸,蒸馏水,（PH均为7,.,.2或7.4,）,）,Tween20月桂酸,（,（,液,液体）,Tween40棕榈酸,（,（,液,液体）,Tween60硬脂酸,（,（,固,固体）,Tween80油酸,（,（液体,）,）,阈值(Cutoff值，阴,阳,阳界值,),),进行大,量,量阴性,标,标本OD值的检,测,测，统,计,计阴性,标,标本的,平,平均值,和,和标准,差,差。,以X+SD为界值,，,，一个,标,标本值,小,小于此,界,界值时,，,，是阴,性,性的可,能,能性为68%,。,。,以X+2SD为界值,，,，一个,标,标本值,小,小于此,界,界值时,，,，是阴,性,性的可,能,能性为95%,。,。,以X+3SD为界值,，,，一个,标,标本值,小,小于此,界,界值时,，,，是阴,性,性的可,能,能性为99%,。,。,为什么,阴,阴性标,本,本会略,显,显色而,不,不是完,全,全无色,呢,呢？,由于目,前,前分离,、,、纯化,、,、检测,技,技术等,方,方面的,限制，,基,基因工,程,程抗原,和,和合成,多,多肽都,不,不可能,达,达,到100%纯,度,度，往,往,往含有2-5,%,%的杂,蛋,蛋白。,同,同时,ELISA反应板,的,的非特,异,异性吸,附,附也不,可,可避免,。,。,阳性标,本,本不显,色,色,（2）基因工,程,程抗原,和,和合成,多,多肽抗,原,原的差,别,别,ELISA试验的,影,影响因,素,素及对,策,策,灵敏度,：,：能检,测,测到的,分,分析物,的,的最小,量,量，,表示检,测,测下限,的,的能力,。,。,相对灵,敏,敏度=,真,真阳性,/,/（真,阳,阳性+,假,假阴性,）,）*100%,1）试,剂,剂盒（,运,运输时,间,间太长,、,、温度,太,太高）,2）试,剂,剂、样,品,品用前,要,要平衡,3）试,剂,剂开启,时,时间长,、,、长菌,4）吸,液,液器吸,量,量不足,5）恒,温,温箱不,足,足37,或温,育,育时间,不,不足,6）洗,涤,涤方式,不,不对,7）显,色,色剂加,量,量不足,8）显,色,色反应,时,时间不,足,足,重复性,：,：对同,一,一样品,重,重复分,析,析的结,果,果间的,符,符合性变异系,数,数CV=SD/X*100%,1）样,品,品加入,后,后未混,匀,匀,2）移,液,液器加,样,样量不,一,一致,3）洗,涤,涤方式,不,不正确,4）唾,液,液或其,它,它杂质,掉,掉入孔,内,内,5）酶,或,或显色,剂,剂B加量不,一,一致,6）标,本,本处理,不,不当,7）酶,标,标仪测,定,定重复,性,性差,8）保,温,温时间,及,及显色,时,时间不,一,一致,9）阈,值,值附近,的,的标本,特异性,：,：对阴,性,性标本,给,给出阴,性,性结果,的,的能力相对特,异,异性=,真,真阴性,/,/（真,阴,阴性+,假,假阳性,）,）*100%,1）配,制,制洗液,的,的蒸馏,水,水污染,2）酶,加,加量过,