大豆蛋白的提取与含量测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,大豆蛋白的提取与含量测定,指导老师,赵建军 曲宁 夏婷 孟繁新,蛋白质性质与应用技术关系图,蛋白质,酸碱,酶,极性,电荷,离子交换层析,电泳,形状,分子量,离心,凝胶层析,肽 氨基酸,疏水性,亲水性,纸,层,析,一、,大豆蛋白的提取,目的要求,1,、,掌握大豆蛋白的提取原理和方法,2、计算粗提产率,2,、学习计算蛋白质收率,实验原理,大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。,称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。,试剂和器材,1,、试剂,（,1,）,10%,Nacl,（,2,）,0.2%NaoH,（,3,）,75%,乙醇,（,4,）,6,mol/L HCL,（5）1mol/L HCL（6）1 mol/L,NaoH,2,、器材,（,1,）离心机,（2）烧杯,（3）滴管,（4）,PH,试纸等,操作方法,1,、,水抽提,将豆粉,5,g,用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提,15,min,，,3800r/min,离心,15,min,，,取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。,其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌），用,6,mol/L,和1,mol/L,HCL,，,调,PH4.55.0,，,3800r/min,，,离心,15,min,，,收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，放入表面皿上，60度烘干，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。,蛋白质产物重量,蛋白质产率,=100%,原料总重量,Folin,酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分,二、,Folin,酚法测定蛋白质含量,目的要求,掌握,Folin,酚法测定蛋白浓度的原理和方法,实验原理,蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，,Folin,酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和,Folin,酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。,Folin,酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏,100,倍。,Folin,酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。,由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用,Folin,酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。,样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。,Folin,酚法有不少个别改进的操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上、保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。,试剂和器材,1,、材料：,本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。,2,、试剂：,（,1,）,0.03,mol/L PH7.8,的磷酸缓冲液。,（,2,）,200,g/ml,的标准酪（牛血清）蛋白溶液。,（,3,）,Folin,试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：,10,g,NaoH,溶于,400,ml,水中，再加,50,gNa,2,CO,3,；,称取,0.5,g,酒石酸钾钠溶于,80,mlH,2,O,中，再加,0.25,gCuSO,4,；,以上两溶液混合定容到,500,ml,，,冰箱保存可用一个月。,4,、,Folin,试剂乙：在,2,升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（,NaWO,4,2H,2,O,）,100g,，,钼酸钠（,NaMoO,2M,2,O,）,25g,，,蒸馏水,700,ml,，,85%,的磷酸,50,ml,，,浓盐酸,100,ml,，,充分混合后，小火回流,10,小时，再加硫酸锂（,Li,2,SO,4,）,150g,，,蒸馏水,50,ml,及数滴溴。然后开口沸腾,15,min,，,以驱除过量的溴，冷却后定容到,1000,ml,，,过滤后呈金黄色，于棕色瓶中保存，可使用多年。,上述制备的,Folin,试剂乙的贮备液浓度一般在2,mol/L,左右，几种操作方案都是把,Folin,试剂乙稀释至1,mol/L,的浓度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1,mol/L,略高。这种稀释18倍后的,Folin,试剂乙就是下文称之为应用液，,Folin,试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用,Folin,试剂乙去滴定1,mol/L,左右的标准,NaOH,溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用,NaOH,去滴定,Folin,乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。,3,、器材：,试管,10,支,试管架一个,移液管：（,5,ml,、,1ml,）,移液管架,洗瓶,恒温水浴,723,型分光光度计,Folin,-,酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：,取,6,支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定,K=0.308 B=-0.009 R*R=0.9909,试管号,0,1,2,3,4,5,S,蛋白质标准液（,ml,）,（,mg),0,0,0.2,0.04,0.4,0.08,0.6,0.12,0.8,0.16,1.0,0.2,提取的样品液（,ml,）,0.8,PH7.8,的,buffer,（,ml,）,1,0.8,0.6,0.4,0.2,0,0.2,Folin,-,甲试剂,（,ml,）,1,1,1,1,1,1,1,于室温下不停地振荡,10,min,Folin,-,乙应用液（,ml,）,4,4,4,4,4,4,立即摇匀，在,55恒温水浴中保温5,min,，,用流水冷却,1,min,后，测,A,650,A,650,值,0,0.184,0.317,0.425,0.536,0.668,？,2,、样品测定：,取三支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1,ml,和空白，如下操作：,试管号,空白,1,2,蛋白质稀释液（,ml,）,（,mg),0 1,1,PH7.8,的,buffer,（,ml,）,1 0,0,Folin,-,甲试剂,（,ml,）,1 1,1,于室温下不停地振荡,10,min,Folin,-,乙应用液（,ml,）,4 4,4,立即摇匀，在,55恒温水浴中保温5,min,，,用流水冷却,1,min,后，测,A,650,A,650,值,3.,蛋白质浓度的计算：,A,650,值对应的,mg,数,(,Pr),Pr(mg/ml)=,稀释倍数,Pr,溶液的,ml,数,思考题,1,、采用,Folin,的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？,2,、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。,