转基因动物与干细胞研究进展ppt课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,转基因动物,与干细胞研究进展,概述,生物体细胞内的,DNA,能精确合成并防止被,DNA,酶降解是由于存在由限制酶与修饰酶组成的生物屏障。,一般情况下，限制酶能将外源,DNA,切割并降解掉，而细胞本身合成的,DNA,由于修饰酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解从而保持遗传稳定性。,概述,但是，偶尔也会发生外源,DNA,幸免降解的情况，使生物体产生小的变异。转基因技术就是利用生物这一特性，把外源基因注入细胞核而获得符合要求的转基因动物。,概述,转基因动物是指基因组中稳定整合有以实验方法导入的外源基因或特定的,DNA,片段的动物。,1974,年美国科学家,Jaenisch,把猿猴病毒,40 (sv40),注入小鼠囊胚腔得到部分体组织中含有,sv40 DNA,的嵌合体小鼠，,1976,年他们建立了世界上第一个转基因小鼠系。,1980,年,Gordon,等首次创建了显微注射转基因法。,20,多年来转基因技术受到广泛的重视和运用并得到迅速发展,目前已经制备出转基因小鼠、大鼠、 兔、 鱼、 牛、 猪、 羊等多种动物的转基因品系。,动物模型在研究人类疾病中起着重大意义,避免人体实验造成的危害,提供发病率低、 潜伏期长和病程长的疾病材料。可增加方法学上的可比性,研究人类疾病发生的分子机制、组织病理,以及药物的治疗效果等。,人类疾病的动物模型,(animal model of human disease),是指医学研究中将动物里的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。,目前人类疾病动物模型的常规获得方法有以下几种：,实验性动物模型,自发性动物模型,实验性动物模型,又称诱发性动物模型,是指研究者通过使用物理的、化学的、生物的和复合的致病因素作用于动物,造成动物组织、器官或全身一定的损害,出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的改变。例如切断冠状动脉分支复制心肌梗死模型。,自发性动物模型,指实验动物未经任何处理,在自然条件下动物自然发生,或由于基因突变的异常表现,通过育种保留下来的动物模型,其中主要包括近交系的肿瘤疾病模型和突变系大遗传疾病模型。,转基因动物作为人类疾病模型,可利用它来研究疾病发病机制、 评估新药疗效。目前国内外科技工作者已经生产出一些人类疾病的转基因动物模型。,已应用和公布的大部分转基因动物模型处在基础研究而不是临床研究。在临床前研究中,转基因动物作为人类疾病模型可应用的数量少,但不断生产的模型被广泛应用于临床前、药物开发。,转基因动物及其研究方法,随着基因工程、基因治疗、转基因生物制品生产等的日趋活跃,其中关键性的基因转移技术已成为医学界研究的重点。,所谓基因转移技术就是将外源性的目的基因,(,包括基因组,DNA ,克隆化的基因及寡核苷酸片段等,),通过特定的方法引入受体生物或细胞,并检测其在转化细胞中表达结果的一种生物学技术。通常这一技术运用在微生物,(,细菌、酵母等,),和植物细胞时被称之为转化,而运用于动物细胞时则被称为转染。,转基因技术开始于上个世纪,80,年代,其主要的研究方法根据外源基因转移时使用的介质不同,可大致分为,物理学法,化学法,生物学法,物理学法,：主要是通过物理的机械的方式,使得宿主细胞通透性增加,便于外源性基因有效地进入受体细胞。,电穿孔法,显微注射法,超声微泡法、声穿孔法,磁场增强转化法,基因枪法,水流动力学注射法,电穿孔法,电穿孔法是将细胞置于专门的高压脉冲电场中,通过电击使细胞膜瞬间出现,105-115nm,左右的可逆性微小穿孔,从而使得外源性,DNA,进入细胞,达到基因转移的目的。该方法最先用于植物细胞及水产动物的转基因研究,目前逐渐在哺乳动物内外胚层的细胞中取得了广泛的运用。,显微注射法,显微注射,法是在显微镜直视下,将在体外构建的目的基因用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中,使这种外源基因整合到受体细胞的基因组将外源性基因直接注射到靶细胞的核内。,此法直接用于体细胞较为困难且效果不明显,多用在生殖细胞,(,特别是体积较大的受精卵细胞,),的基因转移,以构建转基因动物,有效率可达,80%,以上。,显微注射法是目前使用最广泛、效果最佳的转基因动物制作方法之一。,超声微泡法、声穿孔法,作为一种新型的物理基因转移技术,其原理一般认为是由于超声辐射后引起液体中的气体微泡共振破裂产生强大的冲击波等驱动力量促使质膜通透性增加,外源性基因易于向胞内转移。,磁场增强转化法,该法是将微磁珠与目的基因相连,在外部磁场的引导下磁微粒进入靶细胞内,然后与胞内物质作用后将目的基因释放到细胞浆,完成外源性基因的转移。,目前磁转化法已被成功用于体内外反义核苷酸的传递，且不会影响细胞功能,其主要优点,:,低载体剂量下快速高效转化,;,足够磁场强度下能远程寻靶,;,无侵袭性。,基因枪法,这项技术最早应用在植物的转基因研究上,后来被用到哺乳类动物细胞和活体组织实验系统中,基因枪法的原理是将,DNA,吸附到高粘度的微小金属颗粒,(,钨或金,),上,在一种特制的颗粒加速装置的作用下,将这些颗粒高速射入细胞或组织中,以实现外源,DNA,的转移。目前此项技术正在改进中,尚未得到普遍应用。,水流动力学注射法,其原理是利用快速大量注射液体后,流体高压导致细胞膜通透性短暂增加,(30,分钟左右,) ,以提高质粒,DNA,的转染效率。除质粒,DNA,外, RNA,以及寡核苷酸都可以通过尾静脉水流动力学注射进行体内的基因转染,且不会对动物身体造成很大影响。但是要将该方法若应用于人体,尚有待在安全性方面进一步加以证实。,化学法,运用相关的化学试剂,对宿主细胞或目的基因分子进行修饰处理,使得外源性目的基因能够有效进入胞内。主要包括氯化钙法、原生质体转化法、二乙氨基乙基,(DEAE) -,葡聚糖法、磷酸钙沉淀法、脂质体介导法和纳米颗粒介导法等。,纳米颗粒介导法,纳米颗粒是直径在,10-100nm,之间的超微离子,具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应,纳米颗粒能够包裹或表面吸附,DNA,和,RNA,等外源性基因分子,再通过特异的靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄粒作用下进入细胞后被胞内溶酶体降解,释放出外源性基因,从而达到基因转移的作用。,目前纳米颗粒介导法以无毒、无免疫原性、可在血浆中运输不被酶解、高转染效率及转染后可获得稳定表达等优点,越来越成为新近基因转移方法研究的重点内容。,生物学法,利用生物学方法向哺乳动物细胞内转移基因的方法也很多,目前较成熟和常用的就是经过改造的病毒载体系统,(,包括,:,逆转录病毒载体法、慢病毒载体法、腺病毒载体法和腺相关病毒载体法等,) ,此外,还有受体介导法、蛋白转导结构域介导法及精子载体法。此类方法相对物理化学法来说,生物相容性好、基因转移效率高,是值得重点研究的内容。,病毒载体法,将目的基因重组到转录病毒载体上,制成高浓度病毒颗粒,然后感染着床前或者床后的胚胎,也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共育以达到感染目的。此方法虽然十分有效,但具有病毒载体容量有限,安全性差等缺点,不易用于商业性转基因动物。,可作为基因转移系统的病毒载体还包括慢病毒、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和细小病毒载体等。,受体介导法,受体介导法进行基因转移其实是一种细胞内吞的生理过程。首先将多聚阳离子,(,如,:,多聚赖氨酸或鱼精蛋白等,),与配体共价连接,随后与含目的基因的质粒以适当比例在室温下混合后非共价电性结合形成配体,-,多聚阳离子,-,核酸,(,目的基因,),复合物。,受体法以其靶向性好、对细胞无损伤、可大量制备、携带外源基因量大和不产生免疫排斥反应而受到极大的关注。,蛋白转导结构域介导法,蛋白质转导是指把靶物质用重组技术或化学偶联等方法连接到蛋白转导结构域,PTDs,（又称细胞穿膜肽）上,然后通过,PTDs,为运输载体携带靶物质穿透胞膜进入细胞内发挥生物学效应。,核定位信号,(nuclear localization signal, NLS),是一段带正电富含碱性氨基酸的短肽与其旁侧的调控序列构成的信号肽,可以有效地引导其所在序列转运入核。,NLS,介导的入核转运过程具有多步性、单一方向性、温度和能量依赖性及竞争饱和性等特点。,精子载体法,精子介导的基因转移是获得转基因动物的高效方法之一。近年来利用精子作为外源基因的载体来建立转基因动物十分令人注目。,其方法为,:,将成熟的精子与外源,DNA,进行预培养后,使精子有能力携带外源,DNA,进入卵中,使之受精,并使外源,DNA,整合到染色体中。,精子具有主动结合、转运、整合外源,DNA ,并将其内化的能力。结合的,DNA,在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。从而用于,:,制备生物反应器生产基因药物,;,降低异种器官移植的免疫排斥,;,建立转基因疾病动物模型等。,胚胎干细胞法,胚胎干细胞是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多能细胞系,当胚胎干细胞被注入囊胚后可参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。通常利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入中,将有功能的转入基因整合到细胞基因组内的非必需基因位点上,经筛选、培养,而后用于生产转基因动物。,原始生殖细胞技术,原始生殖细胞,(PRIMORDIAL GERM CELLS, PGCs) ,介导的转基因技术在原理和方法上与,ES,细胞技术相似。且在制作转基因家禽方面有明显的优势。,Natiotff 1994,年用此方法制作出了转基因鸡。,转基因动物的应用及其产业化前景,1.,改良动物品种及其生产性能,经过改良的转基因动物可表现出体重增加快、饲料转化率高等优点 等将一基因转入猪的基因组中,发现其表现出明显的肌肉肥大,同时,饲料的利用率也有所提高再有,转生长激素基因的鱼也表现出生长速度加快的特点,日龄的转人生长激素 基因的泥鳅鱼体重是对照鱼的,3-4.6,倍。此外,在羊毛产量的提高、牛奶营养成分的改善以及动物抗病性的提高等方面,转基因技术也有很好的表现。,2.,用转基因动物生产药物蛋白,目前,利用转基因动物生产蛋白药物主要通过三种渠道,一是通过血液,将人的血红蛋白基因转移给猪来生产人血红蛋白,;,二是通过尿液,获得能在尿液中表达人生长激素的转基因小鼠,含量高达三倍,;,2.,用转基因动物生产药物蛋白,三是通过乳腺,动物乳腺是目前公认的生产重组蛋白质的理想器官。动物乳腺具有很强的摄取 、合成以及分泌蛋白质的能力,并能对重组蛋白质进行多种翻译后加工,同时,能将重组蛋白折叠成有功能的构象,.,此外,转基因动物还可用于生产营养医用蛋白,且利润可观,.,3.,生产用于人体器官移植的动物器官,异种器官移植 有可能成为解决移植器官短缺的最有效的途径，目前最有希望成为人类器官移植的供体动物是猪，而要想实现这一目标，首先必须解决的难题是器官移植时出现的超急排斥反应。,4.,建立诊断 、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型,转基因动物疾病模型的研究已成为转基因动物研究的热点,.,利用此项技术,遗传学家可以精确地失活某些基因 如“,KNOCK OUT ”,或增强修复 如“,KNOCK IN,某些基因的表达,从而制作各种究和治疗人类疾病的动物模型和新药的筛选模型。,5.,转基因动物的产业化前景,转基因动物产业化已经取得了初步的进展。仅据,1998,年的统计，全球动物生物技术产品的总销售额已达,6.2,亿美元 ，预计到,2010,年，可达到,110,亿美元，其中,75,亿美元的转基因动物产品。,干细胞研究,1989,年首例脐血造血干细胞,(cord blood hematopoietic stem cells),移植治疗,Fancni,贫血获得成功后,即引起全球的关注。其后,学者们先后分离出不同组织的干细胞,使干细胞的研究进入新的高潮,生命科学研究的又一热点,。,干细胞的研究是,20,世纪,90,年代以来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。,在美国,Science,杂志评选出的,1999,年度,10,大科学进展中,干细胞排名第一。,干细胞,(stem cell),是具有,多种分化潜能,自我更新能力,和,高度增殖能力,的细胞。由于干细胞可无限扩增、易于遗传操作和冻存,且又不失其全能性或多能性,并在适当条件下,可被诱导分化为多种细胞组织。因此干细胞的研究在基础研究领域和临床应用中具有重要的理论和实践意义。,干细胞分类,根据干细胞分化能力的不同可将其分为三类,:,全能干细胞,(totipotential stem cells) ,如,ES,细胞,多能干细胞,(multipotential stem cells) ,如成人组织干细胞。,单能干细胞,(unipotential stem cells) ,如出生后肝细胞的再生来自于肝细胞,若肝细胞再生受阻,则来自于小管细胞。,干细胞分类,根据,分化类别的不同可将其分为,:,神经干细胞,(neuralstem cells) ,包括外周神经干细胞和中枢神经干细胞,。,造血干细胞,包括脐血造血干细胞和外周血造血干细胞,(peripheral blood stem cells),。,上皮,干细胞,(epithelial stem cells),。,视网膜干细胞,(retinal stem cells),。,ES,干细胞,。,干细胞的生物学,特性,多能性或全能性,自我更新能力,高度增殖能力,干细胞,与转基因动物,干细胞的应用,干细胞在生命科学的各个领域都有着重要而深远的影响,如克隆动物、转基因动物的生产、细胞组织和器官的修复和移植治疗、组织工程上有着广阔的应用前景。,“医学的首要目标是有朝一日用生物或人造更换部件 恢复受损或缺少的感官结构。”,-,迈克尔,-,莱文,Scientists Put A Working Eyeball On A Tadpoles Tail,胚胎干细胞,动物克隆技术在不到,5,年的时间里就经历了数次突破。自绵羊“多莉”,1996,年,问世至今,体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端,即成功率低和容易早衰,“多莉”羊在它存活的第,5,个年头也终难逃一劫。,2000,年美国俄勒冈地区灵长类动物研究中心沙顿,(Schatten),实验室应用“胚胎分割”技术,(,当胚胎分裂至,8,细胞阶段,时,，,加工,将其分割成,4,部分分别,培养,，,最终,培育出,4,个完全相同的新个体,),成功克隆出世界上第一只灵长类克隆猴。,与此同时,应用胚胎干细胞进行动物克隆也在世界上许多国家的实验室里获得了成功。,Wakayama,等用长期传代,(30,代以上,),的小鼠,ES,细胞克隆出,31,只小鼠,14,只存活,可见存活率大大提高。因此,ES,细胞克隆动物具有光明前景。,转基因动物是利用受精卵或,ES,细胞作为载体,通过注射目的基因,从而生产带有目的基因的动物。,转基因,ES,细胞系将为大量同系转基因动物的生产奠定基础。应用干细胞进行动物克隆,可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产,以及高效生物活性物质的生产。,胚胎干细胞的优势,1,.,生产克隆动物的,高效材料,:,用,胚胎干细胞作为细胞核的供体进行核移植后,在短期内可获得大量基因型和表型完全相同的个体,。,它,明显优于体细胞克隆动物,后者易出现严重的免疫功能缺陷和突变。,2.,生产转基因动物的,高效载体,:,目前常用的转基因动物的生产方法是向受精卵中注射目的基因。外源性基因的整合表达、筛选工作只能在个体水平上进行。,2.,生产转基因动物的,高效载体,:,利用胚胎干细胞系作为载体,体外定向改造胚胎干细胞,使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行,从而可获得稳定、满意的转基因胚胎干细胞系。,3.,它是目前最,容易,培养克隆动物的一种方法,;,胚胎干细胞制造转基因模型的,过程,如下,:,利用基因重组技术改变胚胎干细胞的基因结构,然后使胚胎干细胞与正常胚胎形成嵌合体,若嵌合体内的胚胎干细胞发展成为生殖系细胞并最终形成精子或卵子,那么在下一代中,必将出现计划中的转基因动物。,人类已通过用胚胎干细胞制造的转基因鼠、兔、猪等动物“复制”了许多种人类疾病,这对了解某些人类疾病的发病机理、发展演化及指导治疗等作出了贡献。,举例,通过用突变的人,-,淀粉前蛋白,(,-APP),基因和突变的人早老基因制出的阿尔茨海默病,(,早老性痴呆,),的转基因鼠模型为了解该病的发展和表现出的行为特征等提供了有益的资料。但对人而言,转基因鼠、兔、猪等动物只能是提供有限的信息。,举例,由于人与鼠在大脑的结构与功能及生理、社会环境等方面的根本差异,转基因鼠至今也没有完全复制出人阿尔茨海默病的全部特征。而灵长类转基因模型的问世将为人类疾病提供相当确切的模型,可用于逐步了解疾病的发病机理、测试某些药物的效率以及某些特异性治疗方法的效果和安全性。,举例,临床上对甲状旁腺功能低下症,(HPT),的治疗效果不甚理想。通过用重组人甲状旁腺激素基因,(PTH),的逆转录病毒液感染小鼠胚胎干细胞后注入甲状旁腺功能低下小鼠的残留甲状腺部位,观察治疗情况。证实人工转入,PTH,基因于胚胎干细胞,使胚胎干细胞不断分化并表达外源,PTH ,从而提供丰富的可进行移植治疗的细胞来源。,神经干细胞,神经干细胞,(NSC),是一种具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂产生新的干细胞和分化潜能逐渐减小的子细胞，并可最终产生中枢神经系统的三种细胞：,神经原细胞,星形胶质细胞,少突胶质细胞,现阶段对中枢神经系统疾病的治疗的很多大分子物质， 如神经生长因子、 脑源性生长因子等都不能通过血脑屏障，使部分中枢神经系统疾病的治疗受到了一定的限制。,基因治疗为此开辟了新途径， 将编码特定神经递质或蛋白质因子的基因转导人细胞或病毒载体， 如纤维母细胞、 星形胶质细胞、 单纯疱疹病毒、腺病毒等， 以治疗中枢神经系统疾病已为人们所熟悉。,用,NSC,有许多其他载体所没有的优点，如： 有自我复制功能；,细胞迁移功能，可远距离迁移至病损部位； 表达稳定，维持时间长；,避免排异反应。,因此它是非常理想的基因载体，目前转导的基因有报告基因、 神经营养因子基因、 递质合成酶基因和代谢酶基因等。,干细胞推广应用存在的问题,虽然神经干细胞应用于基因治疗具有很多优势并且前景光明， 但是目前仍然存在一些问题：,胚胎干细胞是实验室内神经干细胞的主要来源，从目前胚胎干细胞的研究状态来看，获取啮齿类动物的胚泡相对容易，但获取人类早期胚胎,(,胚泡,),往往是困难的，加上对人类胚胎干细胞研究受到伦理道德的限制，使有关干细胞的应用进展缓慢；,如果使用患者自身的干细胞进行治疗， 首先必须从患者体内分离干细胞， 体外培养使其增殖至足够数量用于治疗， 但对于一些急性病症， 无法有足够的时间进行患者自身的干细胞培养；,建立永生化的神经干细胞系，虽然可提供细胞数量上的保证，但存在潜在的致瘤性的问题；,目前神经干细胞的研究除了对帕金森病的研究有部分已应用于临床，其余的研究对象均为大鼠和小鼠，而鼠与人之间的种属差异是显而易见的，加强人神经干细胞的研究迫在眉睫；,转染目的基因的长期稳定表达及调节问题；,干细胞迁移的机制及调控仍不十分清楚。,转基因动物在人类疾病研究中的应用,老年性痴呆,老年性痴呆,(senile dementia ,SD) ,亦称阿尔茨海默病,(senile dementia of Alzheimer type ,AD) ,是一种以临床和病理为特征的进行性、 退行性神经病变。研究发现,65,岁以上者老年痴呆症发病率约为,1 % ,而,85,岁以上者约达,30 %,。预计,2025,年后全球将有,2200,万人患上,AD ,到,2050,年患此疾病的人数将达,4500,万,AD,将成为人类社会的流行病,防治老年性痴呆疾病是当今老年疾病研究领域的最重要前沿课题之一。,老年性痴呆,AD,的基本病理表现在大脑皮层和海马结构的,-,淀粉样斑块。斑块的主要成分是由,-,淀粉样前体蛋白,( -APP),衍生的,38,42,个氨基酸的有神经毒性的多肽。,APP,有多种剪接形式,其中,695,、,751,、,770,为主要形式。,APP,在体内通过,-,分泌酶、,-,分泌酶和核内质溶酶体系统降解产生淀粉样蛋白。,老年性痴呆,AD,是一种多基因的疾病,现已知的主要致病基因有,4,个,:APP,基因, PS - 1 , PS - 2,基因和,ApoE4,基因。近年,转基因动物取得了很大成功。,APP,基因是最早发现的,AD,致病基因。,老年性痴呆转基因动物模型,Hsiao,用朊蛋白,(prion),启动子转入瑞典家族性,AD,的,KM670/671NL,突变基因。获得了,APP,的过度表达。观察到明显的跟年龄相关的淀粉样沉积和伴随记忆缺陷的脑内,A,增加。,Hsiao,在报告中还提到,APP FVB,鼠和,SOD,转基因鼠杂交可以显著提高,寿命,使其有足够的时间形成,A,沉积。,老年性痴呆转基因动物模型,Sommer,等用,Thyl,转入携带瑞典家族性,AD,突变基因的,APP751,变异型。,1,年后这些小鼠也出现了沉积的淀粉样变斑块。,Chen,等进一步证实了过度表达,FAD,的,APP717,密码子突变的小鼠能形成除,NFT,外大部分,AD,的病变,:,淀粉样斑块的沉积、 神经炎性斑、 突触和树突蛋白的丢失、 细胞骨架成分的异常磷酸化、 溶酶体瘀积、 急性时相蛋白、 反应性的星型细胞的小胶质细胞等,同时还表现出了显著的学习和记忆的障碍。,转基因性糖尿病动物模型,通过对试验动物特定基因组分表达的控制从而使该动物表现特定的遗传性状或者通过特定基因敲除的方法可以得到糖尿病动物模型。目前有几种转基因糖尿病大鼠用于研究的报道，但总体还是处于摸索阶段，比较成熟的一般是以小鼠为试验动物模型。,传染病转基因动物模型,一些传染病病原体的致病病原体的致病机理、 疫苗研制、药物筛选等诸多项目的研究一直因缺乏经济可行的天然敏感动物模型而受阻,如,HBV,、,HDV,、,HZV,、,Polivovirus,等自然状态下均只能感染黑猩猩在内的少数几种灵长类动物,致力于对这些病原体敏感、廉价的动物模型的寻找一直是各国学者坚持不懈奋斗的目标。正因为如此,针对他们的转基因动物模型就随着转基因技术的问世应用而产生了,如乙型肝炎病毒转基因小鼠动物模型。,传染病转基因动物模型,乙型肝炎病毒,(hepatitis B virus , HBV),感染与慢性肝炎、 肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。,HBV,是一种宿主特异性极强的嗜肝病毒,制备部分,HBV,基因或,HBV,全基因组的转基因小鼠为研究,HBV,在宿主体内的表达、包装以及分泌等生物学的特性提供了良好的试验材料,也是抗,HBV,药物和临床相关疾病治疗的理想动物模型。,传染病转基因动物模型,转基因小鼠在研究,HBV,的复制及其与宿主的相互作用方面发挥了重要的作用,然而相关研究具有多种缺陷,:,首先,转基因小鼠并非被,HBV,感染,因此无法用来研究病毒进入和在体内的散布,;,第二,转基因小鼠中的病毒,RNA,均来自于整合的,HBV,基因组,在转基因组小鼠肝细胞中未发现,HBV,正常复制所需要的,cDNA(,原因不明,),因此这些模型不太适合于用来研究抗病毒药物对,cDNA,生成的抑制作用。,.,在肿瘤方面的运用,肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变或致癌剂诱变而得,但自发突变率在自然状态下通常很低,而诱变模型也因其不可精确控制性而限制它们的应用。在过去,20,多年间,随着人们对癌基因的激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中的作用认识日益深入,以及近年发展起来的在小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用,在此基础上肿瘤小鼠模型建立工作取得很大进展。运用转基因方法建立了脑肿瘤动物模型。,目前构建转基因肿瘤动物模型主要采用以下途径：,1.,直接将癌基因及促进肿瘤发生、发展的基因转入到动物体内，使这种基因能够在特定的组织表达或非特异性表达。,2.,转入肿瘤血管生成调控基因，从基因水平来调控肿瘤血管生成，利用肿瘤血管生成因子促进或抑制肿瘤形成及生长。,3.,转入肿瘤转移促进基因，主要是金属基质蛋白酶类。,4.,转入肿瘤细胞耐药相关基因。应该指出的是目前多数肿瘤发病机制尚不清楚，但可以明确肿瘤是多因性、多基因疾病。所以在构建人类肿瘤转基因动物模型时不能片面地只考虑某一因素的作用，应多途径综合处理、综合分析。,转基因动物肝癌模型,(1),肝炎病毒转基因肝癌模型 ；,(2) SV40,转基因动物肝癌模型 ；,(3) TGF-a/ C-myc,转基因小鼠肝癌模型 ；,(4) TGF,转基因小鼠肝癌模型,Fator,等利用构建的猪,A1B/ TGF1,转基因小鼠肝癌模型,该模型的肿瘤平均潜伏期为,16,18,个月,肿瘤发生率为,59 %,。,前列腺癌转基因动物模型,在,1996,年,Gringrich,等将,probasin,的启动子中一段,454,个碱基的序列与,SV40,序列连接,转入小鼠受精卵细胞,建立了转基因小鼠前列腺癌动物模型,TRAMP( Transgenic adenocarcinoma mouse prostate),。,转基因胃癌模型,直接调控胃癌的相关基因转染到动物胚胎中而形成肿瘤,如转染了腺病毒,12E1a/ E1b,转基因大鼠在扁平上皮和圆柱形上皮的结合点附近形成了类似与自然发生的胃癌,同时,Thompson,等用长,424bp,的,CEA,促进剂,SV40T,抗原转基因构建了胃腺癌小鼠。,转基因鼻咽癌动物模型,何迎春等利用分子克隆技术构建含突变型,p53,基因和,EB,病毒,LMP1,基因的真核表达载体,pLMP12 p53mt ,采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管,取其产,3,周龄子代鼠进行筛选,成功构建了含突变型,p53,和,EB,病毒,LMP1,基因的双转基因小鼠模型,此模型表现出鼻咽黏膜上皮灶性增生特征,为鼻咽癌前病变机制的研究提供了新的手段。,转基因动物肺癌模型,将人类肺癌中发现的癌基因导入鼠系或肺组织,或者运用基因敲除技术将抑癌基因敲除来制造肺癌模型。,但这些经典的转基因鼠或基因敲除鼠不能复制散发肿瘤经历的生长过程,可能是由于大量癌细胞表达或肿瘤抑制基因的缺失创造的微环境,与散发肿瘤生长过程中仅少量突变细胞包围正常细胞的情况偏离 。,所以人们继而制造了条件控制基因表达的第二代基因鼠,运用癌基因或抑癌基因的等位基因突变技术,如与肺癌有关的,ras,、,raf,、,myc,等癌基因,使鼠肺肿瘤的生长更接近散发肿瘤生长过程,即在肺已完全发育的成年鼠中仅一个亚群的细胞获得突变。,Yang,等将,RFP,标记的黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和结肠癌细胞移植到系统性表达,GFP,的转基因小鼠上,在荧光显微镜下观察肿瘤与间质的相互作用,尤其是肿瘤诱导的血管生成和肿瘤浸润的淋巴细胞。,由于表达,GFP,的新生和成熟的肿瘤血管与表达,RFP,的肿瘤细胞之间区别显著,可以清楚地观察到表达,GFP,的巨噬细胞吞噬表达,RFP,的肿瘤细胞,表达,GFP,的淋巴细胞围绕着表达,RFP,的肿瘤细胞。因此,利用双重荧光标记在活体荧光成像系统对移植肿瘤进行实时观察,可以在活体内动态监测肿瘤血管的形成和发展。,动脉粥样硬化转基因动物,肝外组织获得的胆固醇通过胆固醇逆向转运,(reverse cholesterol transport RCT),回到肝脏排出体内, RCT,起始于肝外组织细胞内胆固醇的流出，以胆固醇从肝脏分泌和粪便中排出体外结束，数个关键蛋白如三磷酸腺苷结合盒转运,体、卵磷脂,胆固醇,酰基转移酶、胆固醇,酯转移蛋白 和,B,类,型清道夫受体 等参与了这个过程 ，由此，针对各类关键蛋白的转基因实验动物也投入了研究，以阐明其在心血管疾病中作用的。,转基因动物在遗传病中的运用,先天愚型,(Downs,综合征, 21,三体综合征,),是一种染色体病,其主要临床特征是智能发育不全、发育迟缓。其在分子水平上主要的致病原因是,21,号染色体上,CuZn,过氧化物歧化酶基因拷贝数超常。将正常的,CuZn,过氧化物歧化酶基因转入小鼠体内,并使之过量表达,该小鼠就表现出与,21,三体综合征相似的表型,因此该小鼠可作为此病的动物模型。,成人多囊肾病,(APKD),是一种多发的遗传病,发病率达,11000, Low don,等人通过过量表达转化生长因子,A(TGF-A ),的转基因小鼠来探索,APKD,的发病机理。,转基因家兔,(transgenic rabbit),是继转基因小鼠之后发展起来的体型相对较大的动物模型,已被广泛的应用在人类脂质代谢、动脉粥样硬化、肥大性心肌病、抗病毒及癌症等研究领域。,另外,转基因家兔也适合用作生物反应器,可以通过其乳腺分泌重组蛋白,用于人类疾病诊断和治疗。在生物医学研究中,虽然家兔模型的应用远不如实验小鼠广泛,但家兔独特的生物学特性,决定了它在生物医学研究中有着啮齿类实验动物无法取代的重要价值。,与其它家畜,(,牛,、山羊、绵羊、猪,),相比,家兔体型较小、 饲养成本低。近交系,( Inbred strains),家兔品系也已经培育成功,、很多,家兔品系也已经实现了,SPF,化,极大的便利了生物医学研究。,如何评价转基因动物模型？,较为理想的疾病动物模型应具备以下几个条件：,1.,动物模型与人类疾病的生物学行为相同或相似。在动物模型上模拟得到的疾病的发生过程、特征与人类疾病相似。,2.,动物易得易养且价格低廉，动物的大小、体型、寿命、繁殖周期等适合于所做的实验研究。,如何评价转基因动物模型？,3.,动物模型构建技术方法简单可行，实验周期短。,4.,动物模型成熟稳定且可重复性好，转基因效率高且死亡率低。,鉴于以上条件考虑很难找到一种完美的动物。但是我们可以针对不同的研究目的、不同的研究方法选择最为合适的研究对象。,转基因动物研究面临的问题,转基因动物研究主要面临两个方面的问题,一是研究过程中存在的困难,二是其安全性问题,转基因动物研究中存在的问题,1.,制作转基因动物的效率极低 转基因动物的制作效率低是制约此项技术广泛应用的关键,.,从总体上看,实验动物转基因的阳性率高于大家畜,.,2.,转基因在宿主基因组中的行为难以控制 转基因在插入宿主基因组的过程中可能导致 内源基因的破坏或失活,也可能激活原本处于关闭状态的基因 尤其是癌基因 其结果将导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡 、四肢畸形等异常,.,3.,多数转基因表达的水平低 大部分转基因,(,尤其是,)cDNA,表达水平很低,几乎难以检测到,但个别基因表达又过高,外源基因的这种高水平表达是宿主动物难以承受的,.,转基因动物的安全性问题,1.,有某些优势性状的转基因动物可能会对生态平衡以及物种的多样性产生不良影响,2.,转基因动物器官移植可能会增加“人兽共患”病的传播机会,3.,用转基因动物生产的食物有可能使食用者发生过敏反应,4.,转基因动物的研究还将会引发一系列社会伦理 问题。为了确保转基因动物对人体的安全性,在大规模生产之前必须对转基因动物进行严格的生物安全检测。,转基因动物伦理问题,目前关于转基因动物伦理问题的研究主要集中在三个方面,:,1.,转基因动物的安全性问题,如基因的插入突变、 基因的异位表达、 基因的表达产物等都可能对动物产生一定的危害。,转基因动物制药安全性问题包括外源基因的插入可能会对宿主动物自身产生的影响和对其生活环境所造成的影响,及转基因动物制品的使用安全性 。,美国科学院在,动物生物技术,:,判定源自科学的忧虑,报告中宣称转基因动物食品固然很好,但环境和这些动物本身却要承担来自生物技术的风险,转基因动物有可能逃脱进入野外与野生同类交配,或者与它们展开生存竞争,像牛和羊这样的大动物几乎不会发生此类问题,但昆虫、甲壳类动物、鱼、啮齿类却十分危险。,朱文进等指出转基因动物食品理论上是安全的,但由于我们对转基因动物的认识目前还很肤浅,所以对于每一种新生产出来的转基因动物食品,在其上市前必须经过长期的、反复的、多方位的安全实验。,2.,转基因动物的专利问题,如转基因动物知识产权保护包括转基因动物生产方法的保护、 转基因动物本身及其后代的保护、 转基因工程产品的保护。,3.,转基因动物的福利问题,转基因动物福利主要取决于人对转基因动物的态度,即人应该善待转基因动物,人道地利用和处置转基因动物,主张在利用转基因动物为人类服务的同时,要尽可能地给转基因动物减少不必要的痛苦和应激,保证转基因动物不受虐待。,美国科学院认为,克隆和基因修饰的真正麻烦是身体和心理上潜在的痛楚。通过生物技术改变的动物会导致行为异常、心理异常和健康问题。与此同时,这一技术也有助于转基因动物风险问题的解决。以大型反刍动物后代生产为例,需要对实施剖腹产手术的母兽提供可能和更多的兽医关照。,外源基因在染色体内的插入是随机的,并不能确定地将外源基因插入某个位点。插入位点的不同可造成不同程度的基因改变,引起非预期效应,例如,有,5 %-10 %,的转基因动物出现肌肉萎缩、 缺肾不育等缺陷。另有相关研究显示,约,29 %,的转基因鼠能够成活,但身体衰弱,只有不足,7 %,的转基因鼠能够正常健康成活。,许多研究者认为标记基因对转基因动物没有伤害,但并不排除它会给受体动物或者消费者带来非预期的效应,如促进新耐抗生素病原体的产生、 或者成为新的致敏原等。英国纳斐尔德生命伦理委员会的报告,从动物到人的移植,:,异种移植伦理,非常强调动物的福利问题,提出在转基因猪的培育、 饲养和摘除器官或组织的各个环节都要避免给动物造成不必要的痛苦。,除以上讨论的转基因动物伦理的三个方面外,关于转基因动物商业化问题的研究也有所涉猎,如转基因鲑鱼上市惹争议,在美国任何人想进口超级鲑鱼的卵,都必须申请许可证,环保部门在确定不会危及当地物种后才会发此证。,唐胜球等从传统消费观念、新的商业垄断、新的疾病曼延、综合经济效益的评价和生物技术安全法规等五个方面探讨了转基因鱼商品化的潜在问题。转基因鱼要进入商业化生产还有一系列难题尚未解决,至今为止,全世界也没有转基因鱼商品化养殖进入市场的确切报道。,目前有关转基因动物伦理研究的文献资料非常零散,研究成果仅仅局限于提出问题,对伦理的探讨只是停留在表面上,缺乏运用基本的生命伦理学原则和生命伦理学理论,以及生命伦理学方法对转基因动物伦理进行系统、 全面和深入的分析和论证。这正是目前转基因动物伦理研究系统性和深入性不够的基本原因。,