实验七 蔗糖酶制备和活力测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验 七 蔗糖酶和制备和比活力的测定,酵母蔗糖酶的制备,各级分蔗糖酶溶液活性的测定,（包括葡萄糖标准曲线的制备）,3.,各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定,4.,各级分蔗糖酶溶液比活力的计算,蔗糖酶制备的原理,酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为,外蔗糖酶，,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有,50%,糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为,内蔗糖酶,，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，,Ser,和,Met,，它们的分子量也不同，外酶约为,27kDa(,或,22,kDa,，与酵母的来源有关,),，内酶约为,13.5kDa,。,两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似,，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验采用研磨水抽提，,提取纯化的主要是外酶,。,蔗糖酶制备的方法,实验方法参看实验指导教材（,p76,）。,注意级分,II,同书上有所不同,。在第二步进行热处理（,50,，,30,分钟）后，离心后将上清转移到离心管中，此时取离心管中的上清约,1.5ml,，放在小离心管中，作为级分,II,。,乙醇沉淀后的固体蔗糖酶，等量分装在两个,1.5ml,的离心管中，,4,下保存，,做为下两次实验中的酶。,蔗糖酶活性测定原理,蔗糖酶特异性催化非还原糖中的,-,呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性,能催化蔗糖水解生成,D-,果糖和,D-,葡萄糖,也能水解棉子糖生成密二糖和果糖,3,5-,二硝基水杨酸与,还原糖,在,强碱性,溶液中,沸水浴,生成棕红色氨基化合物,.,在,540nm,处有最大吸收,在一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比,酶活性单位为,在一定条件下反应,5min,每产生,1mg,葡萄糖所需要的酶量。,实际应用是,1 ml,酶液所产生葡萄糖的量定为,1ml,酶液的活力。,酶的比活力，每,mg,酶蛋白质所具有的酶活力。,葡萄糖标准曲线的制备,加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（,100,）中准确煮,5min,，取出用自来水冷却,3min,，,以零号管调零点,，于,540nm,处测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。,管号,试剂,0,1,2,3,4,5,标准葡萄糖溶液（,1mg/ml,）,ml,0,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,pH5.0 0.1M,醋酸缓冲液,ml,2.0,1.4,1.2,1.0,0.8,0.6,二硝基水杨酸溶液,ml,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.1mol/LNaOH,溶液,ml,2.5,2.5,2.5,2.5,2.5,2.5,酶 活 测 定,取出后经自来水冷却,3min,，以,标准曲线的“,0”,管调零点,，于,540nm,处测光密度值。,以测定管的光密度值减去对照管光密度值，,求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并,乘以,10,，即为每,1ml,酶溶液的活力。（对照管中酶液最后加入）,1,（级分,I,和级分,II,测定管）,2,（对照,I,和对照,II,）,10%,蔗糖溶液,ml,0.60,0.60,pH5.0,醋酸缓冲液,ml,1.30,1.30,25,水浴中保温,3min,0.1mol/LNaOH,溶液,2.5ml,稀释,X,倍,以后的酶液,ml,（级分,I,和级分,II,）,0.10,0.10,25,水浴,5min,二硝基水杨酸试剂,0.5ml,二硝基水杨酸试剂,0.5ml,0.1mol/LNaOH,溶液,2.5,ml,沸水浴煮,5min,蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法）,对照：,0.5ml,水,+5ml,考马斯亮蓝溶液，混匀后室温放置,5,分钟以上。,样品：将级分,I,和级分,II,分别稀释,100,或者,50,倍，取稀释后的酶液,0.4ml,，加入,0.1ml,水，混匀后加入,5ml,考马斯亮蓝溶液，混匀后室温放置,5,分钟以上。,对照作为参比，测定级分,I,和级分,II,的,A,595,。,参照以前实验课中的考马斯亮蓝方法中的蛋白质浓度标准曲线，计算出级分,I,和级分,II,中蛋白质含量。,公式：,y=0.0035x,X,代表溶液的浓度（,m,g/ml,），,Y,代表,595nm,下的吸收值。,实 验 结 果,1,、葡萄糖浓度的标准曲线,2,、蔗糖酶制备过程中的级分,I,和级分,II,中的蔗糖酶的活力。（每,1ml,酶溶液的活力）,0.1ml,稀释后的酶,A540,根据标准曲线计算反应中葡萄糖的产量,稀释的倍数,1ml,酶活力,3,、蔗糖酶制备过程中,1ml,级分,I,和级分,II,中蛋白质的含量。,4,、比活力的计算：,级分,I,和级分,II,中的蔗糖酶的活力,1ml,级分,I,和级分,II,中蛋白质的含量,5,、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（分装两支,1.5ml,离心管中，,4,保存，备用,）,思 考 题,比活力的概念和酶纯化过程中测定比活力的含义。,比较级分,I,和级分,II,的比活力，试分析级分,II,比活力高的原因。,