双向凝胶电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 双向凝胶电泳,(2D-PAGE),蛋白质组分析的技术路线,双向凝胶电泳技术的发展及原理,仪器简介,样品制备,技术流程,1.,蛋白质组分析的技术路线,要求,流程,技术路线,蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的,IEF,和,PAGE,电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新,蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋,白,质,组,分,析,流,程,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N,端测序,肽序列质谱数据,肽,指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,2.,双向电泳技术的发展及原理,双向凝胶电泳的发展,双向凝胶电泳的基本原理,双向凝胶电泳的发展,双向凝胶电泳的思路最早是由,Smithies,和,Poulik,提出,(Smithies O,Poulik,MD.Two-dimensional electrophoresis of serum proteins.Nature,1956,177:1033),，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率,(free-solution mobility),，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。,随后，,Raymond,发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳,(Raymond S,Weintraub,L.,Acrylamide,gel as a supporting medium for zone electrophoresis.Science,1959,30:711),，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶,(Margolis J,Kenrick,KG.Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of,polyac-rylamide,disc and gradient gel electrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057),，这即是双向凝胶电泳,(two-dimensional,polyacrylamide,gel electrophoresis,2D PAGE),。,同年，,2D PAGE,在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即,IEF-PAGE(Dale G,Latner,AL.,Isoelectric,focusing of serum proteins in,acrylamide,gels followed by electrophoresis.,Clin,Chim,Acta,1969,24:61-68,；,Macko,V,Stegemann,H.Mapping of potato proteins by combined,elctrofocusing,and electrophoresis identification of varieties.Hoppe-,seylers,Z,Physiol,.,Chem,1969,350:917-919),。,20,世纪,70,年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠,(SDS)(Barrett T,Gould HJ.Tissue and species specificity of non-,histone,chromatin proteins.,Biochim,Biophys,Acta,1973,294:165-170,；,Martini OHW,Gould H.J.Enumeration of rabbit,reticulocyte,ribosomal proteins.,J Mol Biol,1971,62:403-405,；,Stegemann H.proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen.Angew Chem,1970,82:640),，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础，即,IEF-SDS PAGE,。,1975,年，,OFarrell,、,Klose,和,Scheele,分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳,(OFarrell PH.,High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J,Biol,Chem,1975,250:4007-4021,；,Klose,J.protein mapping by combined,isoelectric,focusing and electrophoresis of mouse tissues.A novel approach to testing for induced point mutations in mammals.,Humangenetik,1975,26:231-243,；,Scheele,GA.Two-dimensional gel analysis of soluble proteins.J,Biol,Chem,1975,250:5375-5385),。,此项,技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一般能分离,1000 3000,个蛋白质点，最好的胶能分离得到,11000,个左右的蛋白质点。,双向凝胶电泳的基本原理,先将蛋白质根据其等电点在,pH,梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行,SDS-PAGE,第二次电泳分离。,第一向进行等电聚焦,(,isoelectric,focusing,IEF),，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性,，,将蛋白质样品加载至,pH,梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动,。,移动过程中,，,蛋白分子可能获得或失去质子,，,并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点,pH,位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点,pH,区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动,。,同样,，,如果蛋白质扩散到高于其等电点的,pH,区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的,pH,梯度介质区域内。目前常使用,预制胶条,(,IPG,immobilized pH gradient),用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的,IPG,胶条在含有,SDS,的缓冲液中平衡。,第二向是将在,IPG,胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到,SDS-PAGE,凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量,(MW),大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行,SDS-PAGE,电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。,IPG,胶的材料是,Immobilines,，,为拥有,CH,2,=CH-CO-NH-R,结构的,8,种丙烯酰胺衍生物系列，其中,R,包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在,pH 310,不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的,IPG,试剂添加至混合物中用于凝胶聚合,，,在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成,pH,梯度。通过这种方式生成的,IPG,不会发生电渗透作用,，,因而可以进行特别稳定的,IEF,分离达到真正的平衡状态。,三种双向凝胶等电聚焦系统,根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：,ISO-DALT,、,NEPHGE,和,IPG-DALT,。,在,ISO-DALT,系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶,(tube gel),中进行，载体两性电解质,(carrier,ampholyte,),在外加电场的作用下形成,pH,梯度，,pH,梯度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，并且一般不能分离等电点大于,8.0,的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到,10000,个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。,NEPHGE,为非平衡,pH,梯度电泳,(,nonequilibrium,pH gradient,electrophoresis,),，是,IPG(immobilized pH gradient),胶发明前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的,pH,也是依靠载体两性电解质和电场来建立。,IPG-DALT,的第一向电泳是采用,1982,年发明的,IPG,胶,(,Bjellqvist,B,Ek,K,Righetti,PG,et al,.,Isoelectric,focusing in immobilized pH gradient:principle,methodology and some applications.J,Biochem,Biophys,Methods,1982,6:317-339),，其,pH,梯度的形成依赖于不同,pK,值的一种合成的化合物,immobiline,，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，,IPG,胶的,pH,梯度是稳定的，不依赖于外加电场，基本上克服了,ISO-DALT,的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于,ISO-DALT,。,非变性,2D-PAGE,：,两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；,非变性,/SDS-2D-PAGE,：,第一向采用非变性,IEF,，,之后在,2%SDS,溶液中平衡；第二向也在,SDS,存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白,-,蛋白间的相互作用。,非变性,/,还原,/SDS-2D-PAGE,：,非变性条件下,IEF,聚焦，之后用,8M,尿素,+5%-ME+2%SDS,进行平衡，再进行第二向,SDS-PAGE,电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、,MALDI-TOF-MS,分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。,变性,2D-PAGE,：,样品先用,2%SDS+5%-ME+95,变性,5min,IEF,在,8M,尿素,+1%NP-40,条件下进行，之后胶条用,2%SDS+5%-ME,平衡，然后进行,SDS-PAGE,。,该技术适于,DNA,序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于,100KD,的蛋白质点少于第三种方式。,双向电泳的分类,3.,仪器简介,第一向：,采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为,10,000,伏；有不同的电压上升方式；可分步进行时间或电压,小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦,24,根,7cm,，,12,根,17cm,胶条；有三个预设程序的方法；有十个用户自定方法；采集运行数据可经,RS232,端口输出或任何热敏打印纸。,BIO-RAD,公司,PROTEAN IEF Cell,等电聚焦仪：,Amersham,pharmcia,Biotech,公司,IPGphor,等电聚焦仪：,电极区域为铜镀金板,；,最多上,12,个样品,；,平台温度为,18-25,1,；,胶条槽,(Holder