生物分离工程-第九章 变性和复性2009

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 变性和复性,内容简介,包涵体的形成及对生物产品的影响,包涵体的溶解（蛋白质变性）,蛋白质复性的方法,第一节,包涵体的形成,包涵体,目前用基因工程表达的蛋白质有,4000,多种，用,E.coli,表达的占,90%,以上，在,E.coli,细胞质内高水平表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的蛋白质，会形成不溶性聚合物,-,包涵体。,E.coli,包涵体,包涵体,包涵体形成原因：,使用高剂量基因和强启动子；,大肠杆菌细胞质环境条件，如,pH,、,离子强度、高还原电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象的条件；,缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的折叠酶，脯氨酰基顺,/,反异构酶，二硫键异构酶，及增强折叠或阻止聚集的分子伴侣等。,超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致这些蛋白质的聚集和错误折叠。,多肽链向蛋白质的转变,过快的蛋白翻译使没有充分的,时间和空间,进行蛋白向高级结构折叠形成热力学最稳定构象,包涵体对分离纯化的影响,有利方面：,蛋白质表达量高；,抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低；,包涵体密度大，易分离；,包涵体的蛋白质纯度较高；,后续蛋白质分离纯化较容易。,不利方面：,需变性复性；,活性蛋白质收率低。,第二节,包涵体的溶解,包涵体的分离,破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；,离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；,洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为,80%,左右，含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、盐酸胍、,Triton X-100,，,脱氧胆酸钠的缓冲液反复洗涤，黏度高时可用,DNAse,（除去核酸）、溶菌酶处理（除去肽聚糖），甚至于可用稀,NaOH,溶液洗涤（脂类皂化），获得较纯的包涵体。,包涵体的分离,1.,用表面活性剂和,NaCl,混合物洗两次,3.,标准蛋白质,5.,表面活性剂洗两次,6.,细胞破碎物,包涵体的溶解,包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作用等，使多肽链伸展。,因此，包涵体的溶解需要强的,变性剂,，如尿素、盐酸胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如,SDS,、,十六烷基三甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠等；,对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇,(DTT),、,二硫基赤藓糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽等使,S- S,键断裂。,包涵体的溶解,由于金属离子具有催化氧化作用，需要除去。需加金属离子螯合剂，如,EDTA,、,EGTA,。,温度一般,25,30,，以促进溶解。,也有用,70%,甲酸溶解包涵体。,在细胞周质内形成的包涵体，可采用原位溶解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解（增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来），无需采用其它破碎细胞方法，再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体溶解液。,第三节,蛋白质复性的方法,蛋白质的复性,在,复性过程中，处于伸展状态的肽链，因暴露在外面的,疏水侧链基团之间的相互作用而使这些分子很容易发生聚集反应，形成沉淀，这是大多数蛋白质复性率低的一个主要原因。,好的复性方法应能够最大程度的抑制蛋白质的聚集反应，促进蛋白质向折叠成正确的空间结构方向反应。,探索高效、方便的蛋白质复性方法对于基因工程产品和理论研究均有重要意义。,实践证明，由于蛋白质自身的复杂性和多样性，没有那一种复性方法适用于所有的蛋白质。,蛋白质的复性,一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点：,活性蛋白质回收率高；,正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；,折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；,折叠复性方法易放大；,复性过程耗时少。,就工业应用，要求折叠复性过程要快速、低成本、高效。,虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需通过实验确定最佳方法和条件。,蛋白质的复性,目前发展的复性方法：,稀释复性,透析、透滤复性,分子伴侣指导复性,色谱法复性：,凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性,、,疏水色谱复性、亲合色谱复性,反胶团复性,双水相复性,3.1,稀释复性法,这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。,为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正交法。,影响复性的条件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓度、复性缓冲液的组成（离子种类、氧化还原试剂、螯合剂）、离子强度、,pH,、,氧化还原电位、复性温度、稀释倍数、混合方式速度等。,稀释复性法,不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异，复性条件和影响因素不同，结果也不同。,研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。,伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应，而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程，动力学多属于一级反应。,两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在,低浓度进行复性,有利于控制聚集反应。,稀释复性法,通常，复性的蛋白质浓度为,10,50g/mL,。,存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性率低的矛盾。,操作方式,一次性稀释：操作方式，速度,分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓,度降低到一中间浓度，最后再完全除去。,连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定,比例连续混合，复性。,分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。,最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为：,稳定正确折叠蛋白质的天然结构，,降低错误折叠蛋白质的稳定性，,增加折叠复性中间体的溶解度，,增加非折叠蛋白质的溶解度，,减少复性中间体接触发生聚集反应。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,聚集反应抑制剂的种类：,可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。,对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。,Zn,2+,和,Cu,2+,可稳定折叠中间体。,浓度为,0.5,1.0mol/L,的,L-,精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,PEG,促进折叠复性，,PEG,与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与,PEG,结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。,在有,PEG,存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与,PEG,的分子量及浓度相关。,认为,PEG,的作用与分子伴侣的作用机理相似。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,非,离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如,Chaps,、,Triton X-100,、,磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。（成胶束，分散蛋白单体作用）,使用它们的不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。,多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子,I,的复性，除了在复性液中加入,Cu,2+,和,Mg,2+,、,2mol,尿素、盐类（,1mol/L,NaCl,、,DTT,）,外，还加入乙醇、甘油等。,单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶,(PDI),、,肽酰,-,脯氨酰顺反异构酶,(PPI),、,分子伴侣、,FK506,结合蛋白、,Cyclophilin,等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。,人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,常用的蛋白质复性添加剂,复性添加剂 复性蛋白质,溶液增熵试剂,GdmCl,荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶,II,，,干扰素,-,-,多肽,尿素 猪生长激素，溶菌酶，,IGF-1,，,干扰素,-,多肽,L-,精氨酸 荧光假单孢菌脂肪酶，鸡卵清溶菌酶，,-,糖苷酶,盐类,(NH,4,),2,SO,4,溶菌酶,糖类 甘油荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，,IGF-1,蔗糖,IGF-1,葡萄糖 溶菌酶,N-,乙酰基葡糖胺 溶菌酶,肌氨酸 溶菌酶,蛋白质复性时聚集反应的抑制,表面活性剂类,Chaps TGF-,类蛋白质，碳酸酐酶,II,Tween,人,生长激素,SDS,干扰素,-,多肽,月桂酰基肌氨酸钠 单链,Fv,片段,十二烷基麦芽糖,MHC,Triton X-100,碳酸酐酶,II,PEG,碳酸酐酶,II,十八烯甘油 碳酸酐酶,II,单,十二酰基磷酸酯 溶菌酶,硫代甜菜碱 鸡卵清溶菌酶,短链醇,正戊醇，正己醇， 碳酸酐酶,环己醇,蛋白质复性时聚集反应的抑制,分子内没有,S-S,键的蛋白质复性相对比较简单，只需抑制聚集反应，不涉及,S-S,键的形成。,S-S,键的形成需要适当的氧化还原条件，对于稀释复性法，最简单的方法是通入空气，进行氧化形成,S-S,键，但氧化速度太慢；最常采用的是适当比例的氧化还原对，如,GSH/GSSG,形成,S-S,键，或使错误,S-S,键重排，促进正确,S-S,键的,形成。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,影响二硫键重排和组建的因素,如果复性蛋白质含有二硫键，在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子量的巯基试剂的混合物，如,谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基苏糖醇,等，其还原型,(13mmol/L),与氧化型的摩尔比为,1:1,到,10:1,。这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成一个还原环境，形成游离的巯基，实际上形成正确的,S-S,键在此环境中也可能被还原。因此，还需在后续步骤加入强的氧化步骤，即加入过量的氧化型巯基试剂，或采用,Cu,2+,诱导的空气氧化，以保证形成正确稳定的,S-S,键。,二硫键重排和组建,在,有,氧化还原对存在下，复性缓冲液的,pH,也很重要，形成,S-S,键的氧化反应，需要碱性条件下进行。,3.2,透析复性法,透析法也是最传统、应用最普遍的蛋白质折叠复性方法。包括借助超滤实现复性的透滤复性法。,由于变性剂均为小分子物质，在透析或超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，达到使变性蛋白质折叠复性的目的。,影响透析和透滤复性的因素与稀释复性复性基本相同。但过程缓慢，耗时间长，效率低。,对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。,3.3,色谱复性法,在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。近年发展十分迅速。其优点是：,色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。,在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，达到复性与纯化同时进行的目的。,便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。,适合蛋白质复性的色谱有：凝胶过滤色谱,(GFC),、,离子交换色谱,(IEC),、,疏水色谱,(HIC),、,亲合色谱,(AFC).,3.3.1,凝胶过滤复性,凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。,进行色谱柱的连续使用，提高使用效率。,溶质分子之间及溶质与分离介质之间无相互作用，活性分子不易变性，活性收率高。,凝胶过滤复性,由于上述特点，凝胶过滤色谱近年开始用于蛋白质复性。,在凝胶过滤复性时，先用复性缓冲液平衡凝胶柱，变性蛋白质溶液上样后进入柱顶，因有高浓度变性剂存在，变性蛋白质有一个随机构象状态和大的动力学水合半径，不能进入介质内空隙，在柱上不能保留。在用复性缓冲液洗脱时，因,变性蛋白质溶液逐步被稀释（色谱峰扩散）,，变性剂和蛋白质浓度降低，蛋白质分子会自发地向热力学稳定的低能态，即蛋白质的天然状态转化，使蛋白质开始复性。,凝胶过滤复性,随时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐渐增加。蛋白质进入介质颗粒内部空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚集，减少了沉淀产生。蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。,3.3.2,亲合色谱复性,是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。,依使用的配体，用于复性的亲合色谱有：抗体亲合色谱、金属亲合色谱,(IMAC),、,脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。,因配体与目标蛋白质间的作用特异性强，且不同配体与不同蛋白质之间的作用差别大，亲合色谱作为蛋白质复性的机理比较复杂。,亲合色谱复性,以金属离子为配体的亲合色谱复性法,如以,Ni,2+,为亲合配体，可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白质的复性。,亲合色谱复性,脂质体亲合色谱复性,脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理可能是：局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质双层作用，以帮助蛋白质进行复性。,比如碳酸酐脱氢酶的复性使用脂质体的柱子，活性收率为,83%,，不用为,58%,。,亲合色谱复性,伴侣亲合色谱复性,分子伴侣是介导表达蛋白质建立天然构象的一类重要蛋白质，也是蛋白质体外折叠复性过程的辅助因子。在复性溶液中加入分子伴侣可提高蛋白质的复性效率，但溶液中引入了杂蛋白，给目的蛋白质分离纯化带来麻烦，且它价格昂贵，而无法应用。而将分子伴侣结合在适当的介质上构成分子伴侣亲合色谱介质，用于目的蛋白质的复性可克服上述缺点。,亲合色谱复性,分子伴侣亲合色谱介导的蛋白质复性与它在溶液中的作用一样。为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消除,变性蛋白质分子间的聚集作用,，使蛋白质在疏水环境中进行“结合,-,释放,-,再结合”的循环过程，直到恢复其天然的构象状态。,利用合成的复杂的固定相体系成功地使一些用稀释法无法复性的蛋白质复性，因此，它又称为“折叠色谱”。,3.3.3,疏水色谱复性,当变性蛋白质与变性剂、杂蛋白进入疏水色谱系统时，由于疏水固定相对变性剂的作用较弱，而对变性蛋白质的作用较强，变性剂首先与与变性蛋白质分离，并随流动相一同流出色谱柱，为复性创条件,而蛋白质特定的疏水氨基酸残基与疏水固定相表面作用形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断在固定相表面进行吸附,-,解吸,-,再吸附，在此过程中，变性蛋白质逐渐复性，形成与天然蛋白质结构相同的蛋白质，流出色谱柱。,在此过程中，不同蛋白质与固定相的作用强弱不同，复性的目标蛋白质可与大部分杂蛋白进行分离。,3.3.4,离子交换色谱复性,变性蛋白质、变性剂及变性液中的其他组分与离子交换介质间的电荷作用，使它们吸附在离子交换固定相表面，由于这些组分与离子交换介质的吸附能力的差别，在洗脱过程中进行不断地吸附,-,解吸,-,再吸附的过程，,使变性蛋白质与变性剂逐渐分离，并在吸附,-,解吸的过程中进行复性过程,。,3.3.5,各种色谱复性方法的比较,凝胶过滤色谱,(SEC),复性法：复性分离过程中，变性蛋白质分子逐渐变小，柱负荷小，,产物浓度低，复性分离时间长，效率较低。,离子交换色谱,(IEC),复性法：柱负荷大，分离效果尚好，最常用的变性剂盐酸胍,在柱保留，影响柱容量，,且往往与蛋白质一起洗脱，使盐酸胍的使用受到限制。,亲合色谱,(AFC),复性法：因蛋白质与介质有特异的相互作用，变性蛋白质分子间聚集反应少，使原不可逆折叠的蛋白质变成可逆，是强有力的复性手段。但使用范围窄，,分子伴侣昂贵，时间长。,各种色谱复性方法的比较,疏水色谱,(HIC),复性法：从高浓度盐溶液中吸附蛋白质，与变性剂瞬间分离，大大降低蛋白质分子间的聚集，为复性可提供疏水环境，有利于复性，若采用梯度洗脱，有利复性和分离，活性收率高，,90%,以上。,色谱复性方法的问题：,在复性过程中不可避免地还是会产生聚集形成沉淀，造成色谱柱的壅塞，柱压很快升高，报废。,较难放大。,展 望,研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性复性原理和技术，解决目前的技术关键。,完善现有技术，实现现有技术的实用化和规模化。,根据现有技术原理，扩大应用范围。,开发实用的设备。,