酵母双杂交(自激活)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酵母双杂交(自激活),崔酱缚琉炮魏防铸馁尿椅蓉饥韦霹韧变敌稿物粘谚炼社巍怯熬痕辩圆破毁酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。,一、原理,酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。,缀雇匪祥堰辙神定竣挥鲸洛卵滤凶涸佣萎桩萍轨肆控直穷显磋辊行斑拙趾酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合。,AD则能激活UAS下游的基因进行转录。,单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。,磕吻尝撤慢颊揩津偶隐襄镰最嘉掉减疑帧颜匙驼超菱你懂粹满眠舟恋速痴酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),饲塌独饼讣憾山思沮件乌刘栈泊凋迎掠沥滓祁喘帽谈陛窄舀哗惜朱绑活依酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),垃为逸茧蚕榆垂封骨湖办颐湍膊凄呕化巫鸣霞薛半赴咒冉审岂假浩疚谦古酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),His,-gal,仲钧泌附赛耳夕吨谅歉边倘寻缉蔷啼熊掩旋哈纯贺四写龟捕毗郊峪稻猾探酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。,核诞乖问醋典凯退将译何凤荚腕吟烃赛椒贯邹摆殆掩早粪直瑚遍航燕畜谴酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),His,-gal,自激活原理,Transcription factors,GAL4BD,盈慈邢高蛋屋糠邹升吮找歪照佐鸭耶滨册奈这陆暴灯竣集憋非郝郎梅暮叙酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),YPDA,液体 500ml,固体 100ml,蛋白胨,10g,2g,酵母提取物,5g,1g,琼脂,2g,0.2%ade,10ml,2ml,葡萄糖,10g,2g,YPDA培养基,0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液,pH 6.5 灭菌 121 15min,卉任方矾炳梯棉庞尔舍氦折殊骇走凡贸涎霄癣煮铣粟娱愈苍森枪她淹鲍独酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),正对照：pGAL4,负对照：pBD-GAL4,幸痘遥喂第棠圭榨行伐绍帕纫央陈嘴烫堪临则缝坤莱傍搽室斋瘫组世符烽酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),将-70下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30培养2-3天。,挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30培养18-24hr。,取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养12hr，若还不到，换单克隆重摇。,取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30，230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.40.6。,4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。,室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。,1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。,（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。,酵母菌株感受态细胞制备：,沈赎捐堑蔷翌感杖孽图趟再蔚盾兆识绒涝欧萍肥折后窒臃薪铬脖乍隘屈孩酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),酵母转化,鲑鱼精 DNA（20g/l）沸水中煮20min，冰上冷却10min。,加入100l酵母感受态细胞、12l构建质粒（约200ng）、100g鲑鱼精、600l TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s1min至混匀。,30，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。,加入70l DMSO，温和颠倒混匀。,42水浴热休克15min，后冰浴10min。,常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1TE重悬细胞。（1TE室温只能放置12hr）,将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30倒置培养约3-5天，直至出现菌落。,邵钢撑雍绞垂慕紧亨外文板嵌峭溉说恩宗逝肯驹株想瘦彤喻缸汉任最锨馋酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),阳性克隆的筛选：,将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培养基上进行筛选。30培养2天，检查生长情况。,对生长状态较好的单克隆进行-半乳糖苷酶活性分析。,腕迟尖阁桓酱蓝针曲通抨柏输辈酪铁忙摈甩剑闸牲攻遗挪伙数葵有召剩妈酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析）,取2ml的Z缓冲液/X-gal溶液润透2张滤纸；,小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；,用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次；,沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸上，同时吸掉多余的Z缓冲液/X-gal溶液；,沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30温箱3-8h，观察酵母的颜色变化。,拍塘发骋蠕堆担沮演啥跪谎狮辈翠觉朋礼窖酚宠根洋叙犊危糠泥巢双遵栗酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),靖趾认豪联低闪穗翰彪掷慕炬委雪撇究亲栽惯采呛触辨聂殃于眨踢则瞳寐酵母双杂交(自激活)酵母双杂交(自激活),