代谢控制育种课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 代谢调节控制育种,代谢调节控制育种是通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。,外因控制,培养调节,内因控制,突变体,1,调节体系,育种措施,诱导,分解阻遏,分解抑制,1,组成型突变株的选育,2,抗分解调节突变株的选育,解除碳、氮、磷源分解调节突变株,反馈阻遏,反馈抑制,营养缺陷突变株,渗漏缺陷突变株,回复突变株,耐自身代谢产物突变株,抗终产物结构类似物,耐前体物突变株,条件突变株,细胞膜渗透性,营养缺陷突变株,生物素、油酸、甘油缺陷型,温敏突变株,2,一、组成型突变株的选育,组成型突变株是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。,这两种突变株在工业上都可能得到应用，特别是在微生物酶制剂工业上。,Regulatory gene,repressor,NO,operator,repressor,NO,operator,3,筛选方法,1,、限量诱导物法,诱变,恒化器,低乳糖浓度,突变株不需诱导物也能合成,-,半乳糖苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能源和代谢原料，而迅速生长。,野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导酶，不能利用乳糖而淘汰。,4,2,、循环培养法,诱变,不含诱导物,不含诱导物,含诱导物,含诱导物,5,3,、鉴别性培养基的应用,诱变后的孢子,以甘油为唯一碳源,涂布,向菌落上喷射,O-,硝基苯酚,-D-,半乳糖苷,组成型突变株,诱导型,原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下,仍能合成,半乳糖苷酶,，将无色试剂水解 ，放出,O,硝基苯酚。,6,4,、筛选,将处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。,例：,-,半乳糖苷酶组成突变株的筛选,底物采用苯,-,-,半乳糖,7,二、抗分解调节突变株的选育,抗分解调节突变株：指抗,分解阻遏,和,分解抑制,的突变,（一）解除,碳,源调节突变株的选育,（二）解除,氮,源分解调节突变株的选育,（三）解除,磷,酸盐调节突变株的选育,选育有关抗分解调节的突变株，其实就是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株,，,使抗生素提前到菌体生长期开始合成，从而延长了产抗期而提高产量。,8,（一）解除碳源调节突变株的选育,在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。,在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不利影响。,根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变株。,9,筛选方法：,1,、循环培养法,2,、鉴别培养基,喷,ONPG,，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野生 型是白色。,3,、特殊氮源,组氨酸酶突变株,葡萄糖,+,组氨酸,分解代谢抑制物,+,唯一必须被分解的氮源,O-,硝基苯酚,-D-,半乳糖苷,（一）解除碳源调节突变株的选育,葡萄糖,乳糖,突变株,野生株,有半乳糖酶,10,4,、葡萄糖结构类似物,CH,2,OH,CHO,OH,OH,OH,H,H,H,H,HO,CH,2,OH,CHO,H,OH,OH,H,H,H,H,HO,CHO,OHO,OH,OH,H,H,H,H,H,3,C-O,CH,2,OH,葡萄糖,2-,脱氧葡萄糖,3,O,甲基葡萄糖,11,特 性：,1,、结构与葡萄糖类似。,2,、不被微生物代谢， 也不阻抑微生物生长。,3,、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还要强。,12,筛选方法：,不含阻遏物,涂布,诱变后的菌株,培养基含有氮源、无机盐、生长因子、低浓度的,2,dG,或,3,mG,及,一种生长碳源 ，该碳源需诱导酶才能利用,验证,含阻遏物,比较,13,例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、酵母膏、蛋白胨及含有,0.01%2dG,的琼脂平板。,木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋白胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、,2-dG,的琼脂平板。,14,抗性突变株的性质,在,2-dG,或,3-mG,平板上生长的菌落接入斜面，对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养基中酶活力往往高于野生型菌株。,含葡萄糖,不含,葡萄糖,含淀粉,15,（二）解除氮源分解调节突变株的选育,次级代谢的氮降解物的阻遏主要指,铵盐和其他快速利用,的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。,筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。,氨基酸,1.5mg/ml,水解蛋白,10mg/ml,16,（三）磷酸盐对次级代谢的调节 机制,1.,通过初级代谢的变化影响次级代谢,加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶的效应物。,2.,改变糖类分解代谢途径：,磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制。,例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃霉素,17,3.,限制抗生素合成的诱导物,甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物,色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸合成酶等的抑制剂；,4.,抑制或阻遏,磷酸酯酶类,的合成,链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些中间代谢产物需经,磷酸化,，因此从中间产物到终产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏磷酸酯酶的合成。,例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。,18,磷酸盐对,ATP,调节：,cAMP ATP,例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐对杀假丝菌素合成的影响。当加入,10mol/L,磷酸盐后，,5minATP,增加,5,倍，,15min,抗生素合成受抑制。,发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。,19,解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育,底部加浸润,250mm/L,磷酸盐的滤纸,灰色链霉菌,诱变后涂布于琼脂平板,含,10mol/LNa,3,PO,4,不含,Na,3,PO,4,脱敏感突变,敏感菌,20,三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用,生物遗传学上：阐述代谢途径,工业微生物代谢控制育种上：筛选到解除反馈的菌株。,21,（一）在初级代谢调节育种的应用,阻断,代谢流或切断支路代谢，使代谢途径朝着有益产物合成方向进行。,还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效应，降低终产物的数量，以,累积支路代谢,中某一末端产物。,22,1,、在直线式生物合成途径中,谷氨酸,N-,乙酰谷氨酸,N-,乙酰,-,-,谷氨酸磷酸,N-,乙酰谷氨酸半醛,N-,乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酰琥珀酸,精氨酸,利用氨基酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵,23,2,、在分支生物合成途径中,葡萄糖,乙酰辅酶,A,柠檬酸,酮戊二酸,谷氨酸,硫胺素,生物素,脂肪酸,谷氨酸棒杆菌营养缺陷型产生,L,谷氨酸的生物合成途径,24,5-,磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,黄嘌呤核苷酸,鸟核苷酸,酶缺失,例：,谷氨酸棒杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸合成代谢途径,协,同,反,馈,25,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,天冬酰胺,赖氨酸,高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径,高丝氨酸脱氢酶,协同反馈抑制,DES,同工酶,26,（二）在次级代谢育种中的应用,丙二酰,CoA,灰黄霉素,四环素,制霉菌素,脂肪酸,抗生素产量受脂肪酸代谢途径的影响,脂肪酸缺陷型,27,氯霉素产生菌初级代谢途径中的,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸,中的任何一个氨基酸发生营养缺陷突变，都会使氯霉素产量增加。,营养缺陷菌株还可以产生新品种。,金霉素第六个碳原子是由蛋氨酸供应，若获得蛋氨酸缺陷型，结果产生去甲基金霉素。,四环素合成中，甲基化酶缺失，便形成了去甲基四环素。,28,例,2,赤藓糖,4,磷酸,+,磷酸烯醇式丙酮酸,莽草酸,预苯酸,L,-,苏对氨基苯丝氨酸,DAPH,分支,酸,L-,对氨基苯丙氨酸,氯霉素,酪氨酸,邻氨基苯甲酸,色氨酸,PABA,杀假丝菌素,苯丙氨酸,其它例子见,p235,29,四、渗漏缺陷型在代谢调节育种的应用,渗漏缺陷型：遗传代谢障碍不完全的突变型,特点：酶活力下降，但不完全丧失，能在基本培养基上少量生长。,筛选方法：,营养缺陷型菌株,基本培养基,30,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,天冬酰胺,赖氨酸,高丝氨酸营养缺陷型菌株赖氨酸的合成途径,高丝氨酸脱氢酶,协同反馈抑制,高丝氨酸,脱氢酶活,力下降，,没有完全,丧失,31,五、抗反馈调节突变株的选育,抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。,其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。,“抗反馈抑制突变型”,“抗阻遏突变型”,Structure gene,product,Enzyme,调节中心,NO,Regulatory gene,protein,product,NO,operator,32,在实际应用中，解除反抗调节可由以下方面：,从遗传上解除反馈调节,各种抗性和耐性育种，回复突变子的应用,截流或减少终产物堆积 借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型,移去产物 借助膜透性突变,33,抗反馈调节突变株获得途径,（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株,（二）耐自身产物突变株选育,（三）抗终产物结构类似物突变株的选育,（四）累积前体和耐前体突变株的选育,34,（一）回复突变引起抗反馈调节突变株,正向突变：,微生物从野生型经自然突变或人工诱变突变成有益突变型。,回复突变：,当具有突变型基因的个体通过再突变又变成野生型表型。,噬菌体敏感,野生型,噬菌体抗性,突变株,噬菌体敏感,野生型表型,前后表型同，但实质有区别,35,1,、回复突变的原因,（,1,）原有基因的回复突变,（,2,）非原有基因的回复突变,原有基因位点 消除,A,基因,C,基因,B,基因,A,C,B,A,C,B,原有基因不同位点,不同基因不同位点,基因内抑制突变,真正回复突变,抑制基因突变,36,区别基因回复突变和抑制基因突变，可以将回复突变菌株和野生菌株进行,回交,试验或,杂交,重组试验来观察它们的子代是否有突变型出现：,杂交结果有同样的,突变型重新出现,，说明回复突变和原来突变型不在同一座位上而是分开的，属于抑制回复突变。反之，如果,杂交后代没有产生突变型,，表明回复突变的座位与原突变型基因位点相同，是真正的回复突变。,37,回复突变的测定,回复突变常发生在遗传物质没有明显获得或缺失的点突变。,苏氨酸营,养缺陷型,基本培养基,38,抗链霉素细菌的回复突变,依赖性突变株：抗链霉素突变株中有少数必须在有链霉素存在的时候才能生长。,诱变后,的菌株,含链霉素,含链霉素,不含链霉素,含链霉素,不含链霉素,依赖性突变株,39,2,、回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选,（,1,）初级代谢途径障碍性回复突变型,原养型,营缺型,原养型,诱变,诱变,酶活力恢复，但调节中心已发生改变，,不能与阻遏物结合，因此解除了反馈调节机制,40,5-,磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,酶活力恢复，,调节中心改变,鸟核苷酸,酶缺失,例：,黄嘌呤核苷酸,41,（,2,）次级代谢途径障碍性回复突变,抗生素回复突变株,零变株：完全丧失产生抗生素的能力，但回复突变株的产量往往比亲株高。,原养型,营缺型,原养型,诱变,诱变,原养型,零变株,原养型,诱变,诱变,例如金霉素、链霉素,42,一个共同的趋势：发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量都比亲株抵，而回复突变株往往比原养型亲株高。,营养缺陷型菌株中，几种不能合成的氨基酸与抗生素合成有关。基因突变的结果，使菌体丧失了合成这些氨基酸的某种酶的活力，导致抗生素产量 下降。,而回复突变导致合成氨基酸的酶的调节中心变化，氨基酸能大量合成。,抗生素大量合成。,分析原因,氨基酸,抗生素,43,甲硫氨酸,金霉素,亮氨酸,缬氨酸,放线菌素,44,（二）耐自身产物突变株选育,自身产物：初级代谢产物,次级代谢产物,大多数抗生素都受本身的反馈调节，特别是氨基糖苷类抗生素。,提高耐受性就意味着提高抗生素的产量。,选育对抗生素不敏感、钝化酶活性高的菌株。,筛选：涂布于含自身抗生素的平板上，逐级提高抗生素的浓度。,45,从土壤中筛选,Aurdox,20-40mg/L,改良培养基和培养条件,500mg/L,紫外线诱变，零突变,0mg/L,紫外线诱变，回复突变,600mg/L,耐自身抗生素,1.6-2.5g/L,46,除耐受自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：,1,、抗,Mg,2+,离子突变，根据以氨基糖苷类抗生素为材料的研究，,Mg,2+,可提高产生菌的耐受性，以此设想筛选抗高浓度,Mg,2+,的突变株，如卡那霉素、新霉素、链霉素等培养基中加入,520mmol/L Mg,2+,能显著提高产生菌自身耐受性。,2,、设想筛选高活性钝化酶的变株，其自身耐受性也会提高。,47,（三）抗终产物结构类似物突变株的 选育,抗代谢结构类似物育种是最早采用并取得显著成效的代谢育种方法。从,50,年代以来在发酵工业上提高氨基酸、核苷酸、维生素产量已取得相当成效，成为当今初级代谢产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。,48,1,、,结构类似物及性质,结构类似物：那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质,性质：,和变构酶的调节中心结合引起阻抑反馈。,假反馈抑制：终产物与酶结合是可逆的。类似物不会掺入细胞结构，酶活性不会恢复。,不像氨基酸那样掺入细胞结构，在细胞中的浓度不变。对微生物具有致死或抑菌作用。,含结构类似物的培养基上，野生型菌株不能生长，抗结构类似物突变株能生长。,解除机制对结构类似物或对终产物都是有效的,49,精氨酸,刀豆氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,2,噻唑丙氨酸,苏氨酸,氨基,羟基戊酸,D,精氨酸,甲硫氨酸,乙硫氨酸,苯丙氨酸,对氟苯丙氨酸,组氨酸,2,噻唑丙氨酸,酪氨酸,对氟病丙氨酸,瓜氨酸,磺胺胍,D,酪氨酸,尿嘧啶,5,氨尿嘧啶,3,氨基酪氨酸,腺嘌呤,26,氨基嘌呤,50,结构类似物的确定（,p242,）,生长抑制试验和敏感性试验,“筛子”的设计,剂量的确定,筛选的具体方法的确定,高产株的检出,3,、结构类似物抗性突变株的获得,51,抗性突变株的检出,A,增殖圈,结构类似物,突变株合成氨基酸,涂工具菌,突变株能够生长，野生型不生长,52,抗代谢类似物的筛选方法，一般采用浓度梯度法：,上层加入含异烟肼培养基,下层不加含异烟肼培养基,浓度逐渐降低,高抗性菌落,敏感菌落,酵母生产吡多醇,53,2,、,较之营养缺陷型有如下优点,（,1,）如果能找到适当的结构类似物，用此种育种方法,简单易行且效果显著,；,（,2,）采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是,通过控制培养基中所需的营养物质浓度,来实现的，并没有从遗传上根本解除代谢调节。由于所需求的营养物质的量不易控制，往往使代谢产物不稳定，而抗结构类似物突变株的,代谢调节被解除，,生产操作方便，产量稳定；,（,3,）抗结构类似物突变株,易于保存，而且不发生回复突变，,只要在保存培养基中加适量结构类似物，即可防止回复突变。,54,谷氨酸,N-,乙酰谷氨酸,N-,乙酰,-,-,谷氨酸磷酸,N-,乙酰谷氨酸半醛,N-,乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酰琥珀酸,精氨酸,直线合成途径,结构类似物：,刀豆氨酸,2-,噻唑丙氨酸,D-,精氨酸,19.6mg/m,L,55,苏氨酸,分支合成途径,天冬酰胺,丙酮酸,异亮氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,赖氨酸,天冬氨酸磷酸,蛋氨酸,结果：,HD,活性提高,1300,倍产量达,14g/L,虽有调节机制，但,Thr,优先合成，,Lys,处于低浓度。,2,氨基乙基,L,半胱氨酸,乙硫氨酸,2,氨基,3,羟,基戊酸,56,举例,L-,赖氨酸合成步骤,天冬氨酸激酶,2,，,3-,二氢二羧酸合成酶,57,从上图可以看出，影响,L-,赖氨酸产量的因素表现在,3,个方面：,一、,L-,赖氨酸和,L-,苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶,二、,L-,亮氨酸会抑制,2,，,3-,二氢二羧酸合成酶,三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而丙酮酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的共同前体，因此丙氨酸等生成可减少赖氨酸的合成。,58,育种过程：,（,1,）在含有,SAEC,（硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物）的培养基上筛选出,SAEC,抗性的突变株，使菌株的天冬氨酸激酶对,L-,赖氨酸和,L-,苏氨酸不敏感。为了进一步的提高产量，接下来还有多种选择：,59,其一、在,SAEC,抗性调节突变菌株基础上进一步筛选,L-,亮氨酸缺陷型突变株，解除,L-,亮氨酸的,2,，,3-,二氢二羧酸合成酶的抑制。,其二、在,SAEC,抗性突变菌株基础上再进一步筛选出,L-,丙氨酸营养缺陷型菌株。,其三，在,SAEC,抗性突变菌株基础上，选育对,SAEC,、,-,甲基,-L-,丙氨酸（,L-,丙氨酸类似物）和,-,氯代己内酰氨（,L-,亮氨酸的结构类似物）具有多重抗性的,L-,丙氨酸营养缺陷型菌株，则,L-,赖氨酸产量会提高更多,60,通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：,61,5-,磷酸核糖焦磷酸,次黄嘌呤核苷酸,琥珀酸腺核苷酸,腺核苷酸,鸟核苷酸,酶缺失,例：,黄嘌呤核苷酸,8,氮鸟嘌呤,62,举例：,S-,腺苷,-L-,蛋氨酸（,SAM,）,SAM,：是甲硫氨酸,(Met),的活性形式。在动植物体内广泛存在，它是由底物,L-,甲硫氨酸和,ATP,经,S-,腺苷甲硫氨酸合成酶酶促合成的。,63,细胞内存在两种,S-,腺苷甲硫氨酸合成酶酶,SAM1,：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在下受到抑制,SAM2,：转录不受蛋氨酸的抑制,据此，可大大提高,SAM2,在,DNA,的拷贝,64,（四）累积前体和耐前体突变株的选育,1,、前体对抗生素生物合成的影响：,（,1,）作为组成成分掺入生物合成,（,2,）导致反馈调节,（,3,）引起毒性,解决办法：筛选耐前体的突变株,65,2,、筛选方法,（,1,）耐“毒性”前体突变株的选育,（,2,）耐前体结构类似物突变株的选育,（,3,）耐前体的有关代谢物突变株选育,66,（,1,）耐,“,毒性,”,前体突变株选育,前体物达到一定浓度后，会抑制终产物的生物合成。,例：灰黄霉素耐前体突变株的筛选,前体为氯化物，浓度由,0.3%,提高到,2.0%,，大幅度提高产量。,67,（,2,）耐前体结构类似物突变株 的选育,前体：色氨酸,浓度高会抑制途径酶的合成，导致抗生素产量下降。,例：,Elander,硝吡咯菌素产生菌：,耐,5-,氟,-,色氨酸和,6-,氟,-,色氨酸变异菌。,68,莽草酸,分支酸,磷氨基苯甲酸,L-,色氨酸,D-,色氨酸,硝吡咯菌素,2-,氨基己二酸,二肽,三肽,-,内酰胺抗生素,半胱氨酸,缬氨酸,蛋氨酸,产量提高,2-3,倍,耐,5-,氟,-,色氨酸,耐三氯缬氨酸,甲氧头孢菌素产量提高,6,倍,69,（,3,）耐前体的有关代谢物突变株选育,天冬氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,丙酮酸,缬氨酸,丙光素,麦迪霉素,4-,丙酰基素迪霉素,添加异亮氨酸或天门冬氨酸促进麦迪霉素合成，低浓度的缬氨酸完全抑制麦迪霉素合成。故筛选耐缬氨酸的菌株。产量提高,1.5-2,倍。,70,四、细胞膜透性突变株的选育,1,、营养缺陷型突变株的选育可改变细胞膜透性,生物素缺陷型,油酸缺陷型,甘油缺陷型,脂肪酸的合成,磷脂,油酸的合成,磷脂,甘油的合成,磷脂,71,2,、温度敏感突变株选育可改变细胞膜透性,突变位置多是发生在细胞膜结构的基因上，一个碱基为另一个碱基置换，这样控制细胞壁合成的酶，在高温条件下失活，导致细胞膜某些结构异常。例如：,TS88,菌株，发酵生产谷氨酸,30,40,生物素,33ug/L,20g/L,72,3,、溶菌酶敏感突变株的选育可改变细胞膜透性,突变株为在,1mg/mL,溶菌酶，不能生长。,0.5,1,2,4,6,溶菌酶敏感突变株,73,