3.In situ hybridization

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,原位杂交,原位杂交,(in,situ,hybridization，ISH),是将核酸分子杂交技术与组织化学或免疫组织化学技术结合起来，利用已知的核酸探针,(probe),在组织细胞的原位显示某种特定基因的存在或其,mRNA,表达的技术。,基本原理,:,磷酸,与,脱氧核糖,以,磷酸二酯键,连成两条,多核苷酸链,两条,多核苷酸链,借碱基之间的,氢键,连接。,A、T,之间有两条；,G、C,之间有3条,碱基种类：,A:,腺嘌呤,G:,鸟嘌呤,C:,胞嘧啶,T:,胸腺嘧啶,U:,尿嘧啶,待测核酸一般是,DNA,或,mRNA,.,探针的主要种类有：,双链,DNA,单链,DNA,DNA,探针,RNA,探针,寡核苷酸探针,探针的制作：,寡核苷酸探针,：化学合成,双链,DNA,探针,：聚合酶链反应（,PCR,）等。,单链,DNA,探针,：,PCR、,化学合成或克隆载体,M13.,RNA,探针,：亚克隆技术：,探针的设计,基本原则是：,G,、,C,之和占碱基总数的,50-60%,。,探针两端的碱基不能是互补的,探针内部的互补碱基不能连续超过,5,个。,尽量避免连续出现,4,个或,4,个以上相同的碱基排列。,寡核苷酸探针的长度通常为,20-40,个碱基。,DNA,探针的长度通常为,80-200,个碱基不等。,RNA,探针的长度通常为,200-300,个碱基不等。,注意其特异性，不可与其他基因有较多的重复碱基排列。,1,atgaagaatc,tttacatcgt,ggctggattg,tttgtaatgc,tggtggccca,51,gactacagca,aatacctaga,cattgccaaa,tttgagagcg,gcatgctgaa,aaagaacagt,aaacttagtc,ggtcaactac,ttcgagacc,accgttccaa,ga,ttttt,aaa,aaggaggaat,aaac,acgaga,a,cacaggtat,gcggtttgta,201,aaccagtaca,cgaatgttta,tcctatacag,ctggatctat,tgcccttacg,251,aaacatgctc,ttaacttt,tg,ctctt,tcgat,gttaacctac,gactatctag,301,ggataataag,agagtcaaag,ggtaaatgcc,actgaagtta ctagtccaaa,351,agtgatttgc,tgtgtaacca,tcagat,aaaa,a,c,ttctcgt,a,attcaaagta,401,atgagcac,aa,aaa,tgagaga,gttttatgac,atacaaaggg,attgtgtgaa,451,ctagcctcaa,ccctgccatc,cttccaggtc,attgttccaa,catggccctg,501,tggatgatgc tcctgcccct gctggccctg ctcgtcctct gggagcccaa,551,gcctgcccag,aacagcacct,cacctggtgg,aggctctgat,cctggtgtgt,601,gggactaact,ggcataatcg cccaatgcta,.,探针标记物的种类：,放射性的标记物,同位素（如,35,S,32,P,）,非放射性标记物,地高辛（,digoxigenin,Dig,）,生物素（,biotin,）,酶（如,HRP、,碱性磷酸酶,）,荧光素,磺基（如光敏,DNP,）,*以,Dig,最常用。,原位杂交的程序,组织的固定：,目的：,保持组织细胞的原有结构,保持细胞内核酸的位置与水平,多采用,4%,的多聚甲醛缓冲液,直接固定,（适合,5mm,3,以下的小组织块）,灌流固定,冰冻切片后固定,4%多聚甲醛磷酸缓冲液,（,pH7.4）,Na,2,HPO,4,12H,2,O,29.01,NaH,2,PO,4,2H,2,O,2.96,焦碳酸二乙酯处理水,(DEPC,水,),800,多聚甲醛,40,g,搅拌,加热至溶解,（65,O,C70,O,C）,追加,DEPC,水,至,1000,焦碳酸二乙酯处理水,(DEPC,水,),的配制,蒸馏水,1000ml,DEPC,1ml,充分搅拌后静置数小时,高压灭菌,(DEPC,乙醇,+CO,2,),DEPC,可灭活各种蛋白质，是,RNA,酶的强抑制剂,有致癌作用,使用时应注意。,切片时注意事项：,环境及,器具的清洁,手套、口罩,DEPC,水,干热灭菌,清洁玻片、涂粘附剂,杂交前处理：,*使用去污剂和蛋白酶处理以消除核酸表,面的蛋白质，增加探针穿透力，提高核酸杂,交效率。,去污剂:,如0.01-0.3%曲拉通(,TritonX,-100);,十二烷基磺酸钠(,SDS)。,蛋白酶:,多用1,ug,/ml,的蛋白酶,K,杂交,用,杂交液,将探针稀释为,0.5-5.0,ng,/,ul,的浓度.每张标本加,10-20,ul,.,置保湿盒,内于50,O,C,恒温箱中反应16-20小时。,（杂交时间不能低于 2-4,h,）,杂交液的配制(10,ml),去离子甲酰胺,5,ml,(,降低解链温度),20,倍浓度,SSC,2.5ml,(,缓冲液),硫酸葡聚糖,1,g,(,提高探针浓度),100,倍,Denhardt,液,500,ul,(,封闭剂),10%SDS,500ul,(,去污剂),10mg/ml,变性鲑精,DNA,100ug,(,降低背景着色),DEPC,处理水,1.5,ml,杂交后处理：,使用不同浓度、不同温度的盐溶液（常用,SSC,）,将非特异性探针结合漂洗清除。并用,RNA,酶,将非碱基配对的,RNA,消化，达到降低背景着色、增加反差的目的。,漂洗原则：,漂洗液浓度由高到低；,漂洗液温度由低到高。,信号显示,：,显示方法因标记物的种类不同而异。,放射性核酸探针用放射自显影法。,非放射性核酸探针用酶检测系统等。,酶检测系统的显色方法与免疫染色,的显色方法基本相同。,常用的酶为,ALP,和,HRP,ALP,用发色基质的种类及呈色,BCIP/NBT,最常用,BCIP,:,5-,溴4-氯3-吲哚,基磷酸,NBT,:,硝基四氮唑蓝,HRP,用发色基质的种类及呈色,DAB,最常用,DAB:,二氨基联苯胺,Dig,标记探针的显色步骤：,加,碱性磷酸酶(,ALP),标记的羊抗地高辛抗体,，,37,O,C,反应1,h,。,缓冲液清洗后加,显色剂,BCIP/NBT,室温反应30-60分钟，阳性部位呈现紫蓝色。,清洗后用,苏木素,或,甲基绿,做细胞核染色。,水洗后根据需要用水溶性封片剂（如,甘油明胶,）封片，或梯度脱水、透明后用,树胶,封片。,Anti D,ig-ALP,BCIP/NBT,FISH,用正意,cRNA,探针所做的,阴性,对照,对照实验,阳性对照：,Northern,和,Southern,印迹杂交法、免疫组化、已知阳性组织标本,阴性对照：,非标记探针、无关探针、,DNA,或,RNA,酶处理标本、,正意,cRNA,探针,思 考 题,何谓原位杂交？简述其基本原理。,