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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,益生菌的工程化改造和作为粘膜免疫的抗原递送系统,简介,人兽共,患,患寄生,虫,虫病的,防,防治技,术,术研究,华支睾,吸,吸虫、,包,包虫、,血,血吸虫,、,、囊虫,疫,疫苗,动物宿,主,主在寄,生,生虫病,的,的传播,中,中起了,非,非常重,要,要的作,用,用，以,期,期通过,对,对动物,宿,宿主的,免,免疫阻,断,断疾病,传,传播,目前，,成,成功的,寄,寄生虫,疫,疫苗极,少,少，希,望,望另辟,蹊,蹊径,主要内,容,容,益生菌,的,的功能,益生菌,在,在疫苗,研,研究中,的,的应用,枯草芽,孢,孢作为,消,消化道,粘,粘膜疫,苗,苗递送,系,系统及,其,其工程,化,化改造,应用前,景,景,存在的,问,问题,益生菌,功,功能,肠道微,生,生态调,节,节功能,（,（通过,消,消耗氧,、,、产生,乳,乳酸等,有,有机酸,、,、种群,密,密度感,应,应、细,菌,菌素等,调,调节肠,道,道正常,菌,菌群和,致,致病菌,群,群的生,理,理平衡,）,）,消化道,营,营养功,能,能（包,括,括合成,人,人体必,需,需的氨,基,基酸、,维,维生素,、,、促进,食,食物消,化,化和吸,收,收的各,种,种酶类),免疫调,节,节功能(通过益,生,生菌的,组,组分促,进,进宿主,免,免疫的,形,形成和,调,调节机,体,体免疫,应,应答，,增,增强宿,主,主的免,疫,疫抵抗,力,力）,益生菌,在,在疫苗,研,研究中,的,的应用,益生菌,应,应用于,疫,疫苗研,究,究，是,基,基于其,独,独特的,生,生理特,性,性和免,疫,疫调节,功,功能,乳酸菌,能,能通过,胃,胃酸环,境,境并在,肠,肠道厌,氧,氧环境,下,下定植,在,在肠粘,膜,膜表面,芽孢杆,菌,菌的芽,孢,孢能能,够,够抵抗,胃,胃酸和,小,小肠消,化,化酶的,作,作用，,能,能促进,肠,肠粘膜,吞,吞噬细,胞,胞的功,能,能和宿,主,主的免,疫,疫应答,皮肤、,消,消化道,、,、呼吸,道,道、泌,尿,尿生殖,道,道是病,原,原体入,侵,侵的主,要,要门户,，,，粘膜,免,免疫对,抵,抵抗各,种,种病原,的,的入侵,发,发挥了,极,极为重,要,要的作,用,用,目前的,疫,疫苗（,减,减毒活,疫,疫苗、,灭,灭活疫,苗,苗、重,组,组蛋白,疫,疫苗、DNA疫苗、,重,重组病,毒,毒疫苗,等,等）主,要,要采用,注,注射免,疫,疫方式,，,，不能,有,有效刺,激,激粘膜,免,免疫。,极,极少有,口,口服疫,苗,苗，主,要,要是疫,苗,苗在经,过,过消化,道,道时易,被,被酸性,环,环境和,各,各种酶,破,破坏，,不,不能产,生,生有效,的,的保护,性,性免疫,新型口,服,服疫苗,以乳酸,杆,杆菌作,为,为表达,系,系统，,将,将外源,抗,抗原进,行,行分泌,表,表达，,刺,刺激肠,道,道粘膜,免,免疫,以枯草,芽,芽孢杆,菌,菌作为,表,表达系,统,统，将,外,外源抗,原,原进行,分,分泌型,表,表达或,表,表达在,芽,芽孢表,面,面，以,分,分泌的,可,可溶性,抗,抗原或,重,重组芽,孢,孢颗粒,抗,抗原形,式,式刺激,粘,粘膜免,疫,疫,将疫苗,的,的特异,性,性保护,与,与益生,菌,菌功能,融,融为一,体,体,枯草杆,菌,菌作为,口,口服疫,苗,苗载体,的,的优势,生物安全性,高,高,枯草杆,菌,菌在营,养,养缺乏,的,的情况,下,下，能,产,产生内,生,生芽孢-,抗,抗性好,枯草芽,孢,孢有独,特,特的免,疫,疫学特,性,性：,口服枯,草,草芽孢,肠,肠道,相,相关淋,巴,巴组织,（,（GALT）识别,活,活化GALT分泌型,（,（SIgA）诱导T、B淋巴细,胞,胞和巨,噬,噬细胞,产,产生细,胞,胞因子,通,通过淋,巴,巴细胞,再,再循环,而,而活化,全,全身免,疫,疫系统,枯草杆,菌,菌作为,口,口服疫,苗,苗载体,的,的优势,枯草杆,菌,菌易于,进,进行遗,传,传工程,操,操作,枯草杆,菌,菌芽孢,生,生产成,本,本低：,枯,枯草杆,菌,菌生长,快,快速，,对,对营养,要,要求低,，,，适于,现,现代工,业,业发酵,生,生产,重组芽,孢,孢疫苗,，,，稳定,性,性高，,方,方便储,存,存、运,输,输，并,可,可以作,为,为食品,添,添加剂,使,使用。,通,通过胃,肠,肠道后,，,，大部,分,分枯草,杆,杆菌芽,孢,孢仍能,存,存活。,正进行,的,的下一,步,步工作,cercariae,metacercariae,meracidia,克隆策,略,略,pUS186质粒,枯草杆,菌,菌基因,组,组提取,PCR扩增枯,草,草芽孢,外,外壳蛋,白,白CotC启动子,及,及结构,基,基因,pGEX-Ag质粒,pUS186,-,-CotC质粒,pUS186,-,-CotC-Ag质粒,转化枯,草,草杆菌WB600,诱导芽,孢,孢形成,重组芽,孢,孢,CotC-TP重组芽,孢,孢的超,微,微结构,示,示意图,芽孢耐,性,性评估,细菌：B.subtilisWB600繁殖体,E.coliJM109，B.subtilisWB600芽孢,主要试,剂,剂,模拟胃,液,液：取10mlLB,用盐酸,调,调PH值至2,.,.0,加,加入胃,蛋,蛋白酶10mg。,模拟肠,液,液：取10mlLB，加胆酸,钠,钠（sodiumcholate）20mg，胰液素,（,（pancreatin）10mg,调PH值至7,.,.4。,1枯草,杆,杆菌芽,孢,孢抗性,评,评估,0min15min30min1h,0min15min30min1h,0min15min30min1h,0.000,0.0024,93.3,图3-1在模拟,胃,胃环境,中,中枯草,杆,杆菌芽,孢,孢的存,活,活率,图3-2在模拟,胃,胃环境,中,中枯草,杆,杆菌繁,殖,殖体的,存,存活率,图3-3在模拟,胃,胃环境,中,中大肠,杆,杆菌的,存,存活率,1枯草,杆,杆菌芽,孢,孢抗性,评,评估,0h1h2h3h,0h1h2h3h,0h1h2h3h,258,.,.0,图3-6在模拟,肠,肠环境,中,中大肠,杆,杆菌的,存,存活率,图3-5在模拟,肠,肠环境,中,中枯草,杆,杆菌繁,殖,殖体的,存,存活率,0.0013,图3-4在模拟,肠,肠环境,中,中枯草,杆,杆菌芽,孢,孢的存,活,活率,92.0,AB,CD,图,免,免,疫,疫荧光,检,检测华,支,支睾吸,虫,虫表膜,蛋,蛋白在,芽,芽孢表,面,面的表,达,达,A:TP31.8；B:TP20.8；C:TP22.3；D:pUS186,-,-Cotc.,举例,华,华支睾,吸,吸虫表,膜,膜蛋白,重,重组芽,孢,孢,芽孢疫,苗,苗免疫,大,大鼠,腹腔注,射,射免疫,SD大白鼠,分,分5组,：,：nave,、,、 pUS186-Cotc芽孢，,及,及pUS186,-,-Cotc-TP31.8,、,、pUS186-Cotc,-,-TP20.8、pUS186-Cotc-TP22,.,.3表膜蛋,白,白表达,株,株芽孢,组,组,用量：腹腔注,射,射11010,口服免,疫,疫,6组：,其,其中5,组,组与腹,腔,腔注射,分,分组相,同,同，第,六,六组为,三,三表膜,蛋,蛋白表,达,达株混,合,合芽孢,组,组（cocktail组）。,乙醚轻,度,度麻醉,大,大鼠后,，,，分别,用,用11010芽孢在第0,、,、1、2、16、17、18、33、34、35天用灌胃针经口,免,免疫各,组,组大鼠,，,，cocktail组为同,时,时给予,三,三表膜,蛋,蛋白表,达,达芽孢,各,各11010。,2.1,腹,腹腔,注,注射免,疫,疫,TP31.8表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP31.8特异性IgG水平(OD450,),),TP31.8表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP31.8特异性IgG1、IgG2a水平,TP20.8表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP20.8特异性IgG水平(OD450,),),TP20.8表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP20.8特异性IgG1、IgG2a水平,TP22.3表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP22.3特异性IgG水平(OD450,),),TP22.3表达株,芽,芽孢腹,腔,腔注射,血,血清TP22.3特异性IgG1、IgG2a水平,口服TP31.8表达芽,孢,孢大鼠,血,血清特,异,异性IgG及粪便IgA水平(OD450,),),naive,CotC,CotC-TP31,.,.8,Day15day32day50,Day15day32day50,A,B,2.2,口,口服,免,免疫,口服TP20.8表达芽,孢,孢大鼠,血,血清特,异,异性IgG及粪便IgA水平(OD450,),),Day15day32day50,Day15day32day50,CotC-TP20,.,.8,CotC,naive,A,B,口服TP22.3表达芽,孢,孢大鼠,血,血清特,异,异性IgG及粪便IgA水平(OD450,),),A,B,Day15day32day50,Day15day32day50,CotC-TP22,.,.3,CotC,naive,口服免,疫,疫第50天粪,便,便中表,膜,膜蛋白,特,特异性IgA水平,肠道黏,膜,膜免疫,为,为肠道,寄,寄生虫,排,排虫主,要,要机制,。,。肠道,免,免疫同,时,时也能,引,引起胆,道,道黏膜,免,免疫系,统,统功能,增,增强，,使,使胆道,特,特异性,分,分泌型IgA升高。胆道分泌,型,型IgA能阻碍,病,病原生,物,物对胆,管,管及肠,道,道黏膜,的,的吸附,及,及其所,分,分泌的,毒,毒性物,质,质对黏,膜,膜的损,害,害，从,而,而增强,对,对胆道,及,及肠道,的,的保护,作,作用。,3 芽,孢,孢疫苗,口,口服免,疫,疫后的,保,保护性,表达的,稳,稳定性,质粒不,能,能连续,扩,扩增和,维,维持，,涂,涂板连,续,续培养10天后，,只,只有5%的菌株,含,含有重,组,组质粒,。,。,草鱼和,麦,麦穗鱼,口,口服芽,孢,孢疫苗,及,及其免,疫,疫效果,将3种TP重组芽,孢,孢杆菌,的,的4 L培养基,离,离心获,得,得的芽,孢,孢沉淀,与,与0.5kg玉米粉,和,和100g鸡蛋清,混,混匀初,步,步制备,鱼,鱼用口,服,服饲料,选择20尾麦穗,鱼,鱼分为,实,实验组,和,和对照,组,组，每,组,组各10尾。同,时,时选择20尾草鱼,鱼,鱼苗，,分,分为实,验,验组和,对,对照组,，,，每组,各,各10尾。,将各组,鱼,鱼苗在,实,实验室,生,生态池,内,内常规,饲,饲养，,每,每天作,换,换水及,消,消毒处,理,理。每,天,天早晚,投,投喂研,究,究制备,的,的鱼用,口,口服饲,料,料，每,次,次投喂1 g,/,/10尾,连续投,喂,喂4周后，,将,将筛选,阳,阳性的,纹,纹沼螺,放,放入小,方,方皿中,释,释放尾,蚴,蚴，收,集,集200条尾蚴,放,放入小,碗,碗中，,放,放入鱼,进,进行攻,击,击感染,。,。,每组感,染,染攻击,感,感染后4周后分,组,组检测,比,比较鱼,用,用口服,饲,饲料预,防,防麦穗,鱼,鱼和草,鱼,鱼感染,华,华支睾,吸,吸虫尾,蚴,蚴的效,果,果,单纯芽,孢,孢喂食,组,组囊蚴,的,的回收,率,率，囊,蚴,蚴回收,率,率草鱼,为,为80%，麦穗,鱼,鱼为145,%,%。3种重组,芽,芽孢混,合,合喂食,组,组，均,未,未发现,囊,囊蚴?,重组枯,草,草芽孢,疫,疫苗的,应,应用前,景,景,适合做,禽,禽畜、,水,水产的,益,益生菌,微,微生态,制,制剂,适合各,种,种病原,（,（尤其,是,是经消,化,化道和,呼,呼吸道,感,感染）,的,的感染,性,性疾病,的,的疫苗,载,载体,实现益,生,生菌和,疫,疫苗功,能,能的复,合,合型动,物,物饲料,添,添加剂,和,和食品,添,添加剂,。,。,风险评,价,价,在连续,喂,喂食重,组,组B.substilis芽孢菌30天的大,鼠,鼠肠腔,分,分离的,其,其他菌,株,株中未,发,发现有,重,重组质,粒,粒的水,平,平转移,质粒携,带,带的卡,那,那抗性,基,基因水,平,平转移,的,的可能,性,性很小,重组质,粒,粒在活,菌,菌内难,以,以持续,扩,扩增和,传,传代，,会,会逐步,消,消失，,对,对环境,影,影响小,。,。,存在的,问,问题和,解,解决策,略,略,重组枯,草,草芽孢,不,不能在,肠,肠道定,植,植，芽,孢,孢一次,性,性排出,率,率在99.5%以上，,要,要实现,足,足够的,免,免疫，,服,服用剂,量,量要大,，,，次数,多,多,要解决,枯,枯草芽,孢,孢杆菌,繁,繁殖体,在,在肠粘,膜,膜的定,植,植能力,（,（改变,菌,菌株生,理,理）,重组芽,孢,孢申报,的,的功能,定,定位和,法,法规限,制,制（遗,传,传修饰,的,的菌株,不,不能申,报,报为益,生,生菌，,采,采用重,组,组蛋白,吸,吸附在,芽,芽孢表,面,面的物,理,理载体,策,策略）,我国关,于,于益生,菌,菌的法,律,律法规,刻,刻舟求,剑,剑，是,否,否应该,调,调整，,以,以促进,益,益生菌,行,行业的,发,发展？,希望与,各,各位同,仁,仁合作,促进益,生,生菌技,术,术的应,用,用与发,展,展！,谢谢各,位,位！,
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