1 基因工程概述

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程,主讲人：孙全,E-,mail:sunquan,重庆邮电大学生物信息学院,College of,Bioinformation,Chongqing,University of Posts and,Telemunications,(Genetic Engineering),感谢舒坤贤老师提供的原始课件！,参考书籍,(References),4,.,Sambrook, J.,等，,分子克隆实验指南（第三版）, 2001.,3.,吴乃虎,基因工程原理，第二版,(,上、下册,),科学出版社,1998/2001,2.,张惠展，基因工程，华东理工大学出版社，,2005,1.,马建岚 ，基因工程学原理，西安交大出版社，,2001,绪 论,- Kathryn Sullivan,(The first woman walking in space),I first saw the earththe whole earth from the shuttle Challenger in 1984. The view takes your breath away and fills you with childlike wonder.,杨利伟拍摄的美丽的地球家园,Life distinguishes our globe from any other planets.,生命使我们的家园区别于所有别的星球,Life is beautiful!,Diverse is beautiful!,How is it programmed so timely and so correctly?,- Inheritable is beautiful!,Whether you believe it or not!,“,The only thing a man “gives” his baby is something called DNA,.”,Nothing would be more fascinating,than to explore the mysteries of life,and ourselves!,父亲,“,传,”,给了女儿什么？,DNA,Simple is beautiful!,The Microbes,Evolutionary is beautiful!,-,Biotech is “biologically applicable”,Nothing is more beautiful than life!,一、基因工程的含义,1,、生物技术是一门最古老的技术；,2,基因工程,(,Genetic Engineering,),的概念,A,狭义：基因工程是指将一种生物体（,供体,）的基因与,载体,在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（,受体,）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的,DNA,体外操作程序，也称为,重组,DNA,技术（,DNA Recombination,),或,分子克隆技术,(,Molecular Cloning,),。,因此，,供体、受体、载体,是重组,DNA,技术的三大基本元件。,B,广义：,基因工程是指重组,DNA,技术的产业化设计与应用，包括,上游技术,和,下游技术,两大组成部分。,上游技术,指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组,DNA,技）；而,下游技术,则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,克隆,的寓言,造人是人类的一种集体潜意识,Then God said,“Let us make humankind in our images,according to our likeness”,上帝为什么要照着自己的样子造人？,最早的无性繁殖传奇,上帝从亚当身上复制出夏娃,Then the man said,“This at last is bone of my bones and flesh of my flesh;this one shall be called woman,for our of Man this one was taken.”,肋骨造人象征什么？组织工程学？遗传信息相传递？体细胞核移植？,16,世纪，维萨里,人体的构造,：男人的肋骨与女人一样。,不知道他是否想过：一个比肋骨小得多的体细胞便能“复活”一个生命？,The Fist Sin and Its,Pubnishment,亚当夏娃被逐出伊甸园，人类开始了最初的有性繁殖。,进步意义：有性生殖产生的基因重组，导致了变异，物种越变越复杂，产生了进化上的飞越！,矛盾：假如我们的始祖只有男女二人，那么，谁是异族？如果这二人是同族的话，那么他们的性关系就是近亲相好。我们作为他们的子孙，就是由罪孽的结合,违反伦常的有性生殖,而繁衍出来的。这个谜之所以引人注目就在于它常常伴随着意味深长的论理问题。,几个古代圣贤的传说,圣母玛利圣灵感孕：耶稣的诞生！,伏羲的母亲前氏踏雷泽的“大迹”而生伏羲；大禹的母亲“见星贯昂，梦接意感”，而后又“吞神珠”，才生下大禹的。（,太平御览,）,黄帝的母亲“见大雷绕北斗，枢星光照郊野”，然后感而孕，生下黄帝（,初学记,）。,圣人皆无父，感天而生（,春秋公羊传,）。,现在，“多莉”的“造物主”吃禁果了！对造出新罪孽的恐惧，就是基因时代教俗两界新的心里压力。,“,多莉,”,的研究者,伊斯维姆,.,穆特,克隆羊,“,多莉,”,吴明杰小组：,5,只克隆猪,西游记,中的孙悟空与美国克隆猴子,美国克隆了猴子，“齐天大圣”有何感想？,争论的焦点是,克隆人,问题,!,“,克隆,”,其实是我们的日常生活中经常遇到，只是没叫它,“,克隆,”,而已。,无心插柳柳成荫,马铃薯,你见过,克隆人,吗,?,人类有足够的力量阻止“克隆人”的诞生吗？,In Gene Times:To be, or not to be? This is a problem!,二、基因工程诞生的理论基础,1,、基因的研究,孟德尔的“遗传因子”,The Century of the Gene began with the re-discovery,of the basic laws of life-,The laws of inheritance of life,丹麦生物学家,Johannsen,创造“基因”（,gene),一词,意为“给予生命”,Morgan,把基因定位在染色体上,Miescher,发现了核酸（,nucleic acids),2,、遗传物质是,DNA,（少数病毒除外）,A real beginning of life sciences,began with the establishment of,the,Double Helix Model of,DNA,3. DNA,双螺旋结构,Maurice Wilkins,Rosalind Franklin,1957,年,Crick,又提出了遗传信息传递的,“,中心法则,”,DNA,RNA,protein,1964,年,Marshall Nirenberg,和,Gobind,Khorana,等终于,破译了,64,个遗传密码,4.,中心法则和遗传密码,移动基因；,断裂基因；,假基因；,重复序列及重复基因；,重叠基因。,5,、基因的现代概念,6.Human,Genome,Project,Genetics: to study a single or a few genes,Genomics: to study all genes in a genome or genomes,生命的奥秘蕴藏于,“,四字天书,”,之中,Secrets in the,“,4 Letter Book,”,of Life,G,C,TT,C,TT,CC,T,C,A,TTTT,C,T,C,TT,G,CC,G,CC,A,CC,A,T,G,CC,G,CC,A,CC,A,T,C,A,TTTT,C,T,C,TT,G,CC,G,CC,A,CC,A,T,G,C,TT,C,TT,CC,T,C,A,TTTT,C,T,C,T,CC,A,CC,A,T,G,CC,G,CC,A,CC,A,C,G,CC,A,CC,A,T,G,C,TT,C,TT,CC,T,C,A,T,C,T,C,G,C,TTT,C,TT,G,CC,G,CC,A,CC,A,T,G,CC,G,CC,A,CC,G,C,TT,C,TT,CCt,T,C,T,C,T,Life sciences are,sequence-based,元素周期表奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础,元素周期表,“,基因组序列图,”,将奠定二十一世纪,生命科学研究和生物产业发展的基础！,“,人类基因组计划”的科学意义,人体解剖图奠定了,现代医学发展的基础,“,人类基因组计划,”,的社会意义,“,人类基因组计划”在科技合作与共享、人类和谐与进步、世界和平与持续发展等多方面的意义,远远超过了“曼哈顿原子弹计划”,和,“阿波罗登月,计划,“,三、基因工程诞生的技术突破,1.,限制性内切酶（,restriction enzymes,）,1970,年,H.O. Smith,等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber,理论预见限制酶,Daniel Nathans,用限制酶切得,SV40 DNA,片断,Hamilton O. Smith,得到第一个限制酶,1978,年,Nobel,生理或医学奖,2. DNA,连接酶（,ligase,）,1967,年,5,个实验室几乎同时发现了,DNA,连接酶。,3.,载体（,vector,）,1972,年前后使用小分子量的细菌,质粒,和,噬菌体,作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,4.,感受态体系,1970,年,M. Mandel,和,A.,Higa,发现经过,氯化钙,处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体,DNA,。,1972,年,S. Cohen,发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒,DNA,。,5.,琼脂糖凝胶电泳,1960s,发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的,DNA,分离开。,6. DNA,测序技术,1975,年,F. Sanger,、,A.,Maxam,和,W. Gilbert,发明了,DNA,快速测序技术。,1980,年,Nobel,化学奖,四、基因工程的发展历史,1980,年,Nobel,化学奖,1972,年斯坦福大学的,Paul Berg,小组完成了首次体外重组实验：,1. Berg,的开创性实验,将,SV40,的,DNA,片断与,噬菌体的,DNA,片断连接起来。,（用,DNA,末端转移酶，而非限制性内切酶）,2. Boyer-Cohen,实验,1973,年斯坦福大学的,S. Cohen,小组将含有,卡那霉素抗性,基因的大肠杆菌,R6-5,质粒与含有,四环素抗性,基因的另一种大肠杆菌质粒,pSC101,连接成重组质粒，具有,双重抗药性,。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同,pSC101,质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的,mRNA,。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen,实验,Stanley Cohen,1986 Nobel,生理或医学奖,Herb Boyer,产品,首次克,隆时间,国家,用途,首次进入市场时间,国家,/,地区,人生长激素释放抑制素（,SRM,）,1977,日本,治疗巨人症,重组人胰岛素,(,Humulin,),1978,美国,治疗糖尿病,1982,欧洲,人生长激素,(HGH),1979,美国,治疗侏儒症，延防衰老,1985,美国,人,干扰素（,-IFN,）,1980,美国,/,瑞士,治疗病毒感染,1985,欧洲,人乙肝疫苗,(,HBsAgV,),1983,美国,预防乙型肝炎,1986,欧洲,人白细胞介素,2,（,IL-2,）,1983,日本,治疗肿瘤,1989,欧洲,人促红细胞生成素（,EPO,）,治疗贫血,1988,欧洲,人粒细胞集落刺激因子,(G-CSF),治疗中性白细胞减少症,1991,美国,人组织纤溶酶原激活剂,(t-PA),治疗血栓症,198,美国,3,、基因工程的成熟和腾飞,2000,年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“,Alba”,。,应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子,Alba,。,在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。,2.,重组体的制备,五、基因工程的主要操作内容,1.,目的基因的获取,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或,PCR,扩增等步骤，分离出带有,目的基因,的,DNA,片断。,将目的基因的,DNA,片断插入到能,自我复制,并带有,选择性标记,（抗菌素抗性）的,载体,分子上。,将重组体（载体）,转入,适当的受体细胞中。,4.,克隆鉴定,3.,重组体的转化,挑选,转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,5.,目的基因表达,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,1.,对环境的影响,2.,新型病毒的出现,重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,（一）、基因工程的安全隐患,六、,基因工程的安全性,将肿瘤病毒或其它动物病毒的,DNA,引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4.,人造生物扩散,新组成的重组,DNA,生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,3.,癌症扩散,1.,公众的担忧,（二）、重组,DNA,研究的安全准则,1973,年美国的公众第一次公开表示担心应用重组,DNA,技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974,年美国国立卫生研究院（,NIH,）考虑到重组,DNA,的潜在危险，提请,Paul Berg,博士组成一个重组,DNA,咨询委员会。,这个由,11,名分子生物学和重组,DNA,权威学者组成的委员会在同年,7,月发表公开信（,science,158,303),，要求在没有弄清楚重组,DNA,所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（,带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒,）。,2.,专家的态度,3.,制定安全规则,1976,年,6,月,23,日，,NIH,正式公布了,“,重组,DNA,研究的安全准则,”,。,规定了,安全防护（物理防护和生物防护）标准,以及,禁止,若干类型的实验。,1979,年、,1981,年、,1989,年,NIH,又做了多次修改，放宽了许多限制。,分,4,级：,P1P4,级。,（,1,）实验室的物理安全,4.,基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。,P1,级实验室,P2,级实验室,在,P1,级实验室的基础上还装备有,负压,的安全操作柜。,全负压,的实验室，同时装备安全操作柜。,P4,级实验室,专用的实验大楼,，周围与其它建筑物应有隔离带。,具有最高安全防护措施。,P3,级实验室,在自然环境中,无法,存活。,（,2,）实验室的生物安全,分,3,级（大肠杆菌）：,EK1EK3,级。,EK1,级的大肠杆菌,在自然环境中,一般,都要死亡。,EK2-EK3,级大肠杆菌,第一个“安全”菌株是,K12,（,1976,年），很不实用，已淘汰。,（,3,）,载体的安全,应该是失去了,自我迁移,的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。,（容易构建）。如,pMB9,，,pBR322,等。,（一）、基因工程在农业生产中的应用,1.,提高植物的光合作用效率,七、,基因工程的应用,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（,1,）提高,CO,2,的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（,2,）提高光能吸收率和转化率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,2.,提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。,是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些,优质性状,（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,3.,转基因植物,大棚种植的转基因,(,抗青枯病,),马铃薯,世界各国转基因作物大田释放情况（,1987.1-1998.4,）,转基因作物特性,批准项数,所占比例,抗除草剂,1297,29.6%,抗虫,1046,23.8%,产品质量高,886,20.2%,抗病毒,436,9.9%,农学性状好,211,4.8%,抗真菌,208,4.7%,其它,303,6.9%,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。,使动物成为,生物反应器,生产有用的活性蛋白等。,4.,转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（,TPA,）和尿激酶的转基因小鼠；,分泌,a1,抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,第一例转基因动物转基因超级小鼠,（二）、基因工程在工业中的应用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,1.,纤维素的开发利用,2.,酿酒工业,（三）、基因工程在医药上的应用,1976,年，,27,岁的风险投资人,Robert Swanson,与,University of California,的教授,Herb Boyer,共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为,Genentech,（,Gen,etic,En,gineering,Tech,nology,）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech,的骄人业绩,1976,Genentech,创立,1977,首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素,1978,克隆了人胰岛素基因,1979,克隆了人生长激素素基因,1980,公司上市，募集,$ 35million,1982,第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给,Lilly,公司）,1984,第一个,VIII,因子，转让给,Cutter Biological,1985,第一个自己生产的产品（人生长激素）,1987,生产组织纤溶酶原激活剂（,TPA,）,1990,生产,interferon,1,1990,与瑞士,Roche,医药公司合并（,$ 2.1billion,）,制造新型疫苗（如,HIV,、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、,SARS,）,2.,用微生物生产药物,3.,技术设计高效高特异性的生物制剂,4.,研制疫苗,1.,用转基因植物或动物生产药物,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,国家,发展策略,投入资金,临床试验,上市品种,产值,美 国,支持基础，创新，主导,领先水平,100,亿,US$/,年,350,2001,（,1-19,）,110,2001,（,1-6,）,27,200,亿,US$/,年,日本,合作，实用化，信息化,两千亿日元,/,年,50,种以上,50,五千亿日元,/,年,德国,创新，转让，加大投入,100,68 2001 (12),中国,重视，优先、优惠,20,余种,20,30,亿人民币,美国已批准上市的基因工程药物（,1997.7,）,中文名称,商品名称,英文名缩写,开发公司,胰岛素,Humulin,Novolin,Humalog,Insulin,lispoinsulin,Lilly,Novo Nordisk,Lilly,人生长激素,Protropin,Humatrope,NutropinAQ,rhuGH,Genentech,Lilly,Genentech,干扰素,IntronA,ReferonA,Avonix,Betaseron,Actimmune,Alferon,-N,rhuIFNa2b,rhuIFNa2a,rhuIFN,rhuIFN,1b,rhuIFN,1b,rhuIFNa3,Schering,Roche,Biogen,Chiron,Genentech,Interferon Science,白细胞介素,2,Proleukin,rhuIL2,Chiron,粒细胞集落刺激因子,Neupogen,rhuG,-CSF,Amgen,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,Leukine,rhuGM,-GSF,Immunex,红细胞生成素,Epogen,Procrit,rhuEPO,Amgen,Ortho,组织溶纤原激活剂,Activase,rhuTPA,Genentech,生长激素,Serostin,somatotropin,Serono,促生长素,Nutropin,Saizen,Genotropin,Norditropin,Bio-,Tropin,somatopin,Genentech,Serono,Pharma,/Upjohn,Novo Nordisk,Biotech General,抗血友病因子,VIII,Kogenate,Recombinate,Factor VIII,Bayer,Baxter,葡萄脑苷脂酶,Cerezyme,glucocerebrosidase,Genzyml,脱氧核糖核酸酶,Pulmozyme,domase,Genentech,乙型肝炎疫苗,RecombivaxHB,Engerix,B,Comrax,Hepatitis B vaccine,Merck,Smith Kline,Merck,甲型肝炎疫苗,Havrix,Hepatitis B vaccine,Smith Kline,体内用单克隆抗体,Reopro,Ortho OKT-3,Onco,Scint,CR/OV,Onco,Scint,OC103,Onco,Scint,CR103,Prostascint,MAB,blood,clots,MAB,Kidney,sup,MAB,diag,inject,Centocor,Ortho Biotech,Cytogen,Cytogen,Cytogen,Cytogen,鼠单克隆抗体,Panorex,Murine,MAB,Glaxo,Welcome,中国已经批准上市的基因工程药物（,1998.5,）,药品名缩写,开发生产公司,批准时间,适应症,rhuINFa1b(,外用）,rhuINFa1b,rhuINFa2a,长春生研所,上海生研所,深圳兴科,长春生研所,长生药业,三生药业,1989,试,1996,正,1996,正,1996,正,1997,正,1997,正,病毒性角膜炎,HBV,HCV,HBV,HCV,尖锐湿疣，疱疹等,HBV,HCV,HBV,HCV,rhuIFNa2b,新大洲药业,里亚哈尔,华立达,安科,华新,1997,正,1996,正,1997,正,1997,试,1997,试,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,rhuINF,上海生研所,克隆,丽珠生物工程,1994,试,1995,试,1995,试,类风湿,类风湿,类风湿,rhuIL2,长春生研所,长春药业,四环制药,华新,三生药业,深圳兴科,中华合通,金丝利,康利制药,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1995,试,1995,试,1995,试,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,rhuG,-CSF,九源,1997,试,化疗生白血病,rhuGM,-CSF,特宝,1997,试,化疗生白血病,rSK,医大实业,1996,试,心梗溶栓,rhuEPO,华欣,永铭维沃,1997,试,1997,试,再生障碍性贫血,再生障碍性贫血,bFGF,（外用）,珠海东大,1996,试,创伤，烧伤,我国生产的基因,工程疫苗和药物,6.,法医鉴定,7.,基因治疗,5.,基因诊断,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索阶段）,第一例基因治疗的疾病是,1990,年,9,月,FDA,批准的用,ada,（,腺苷脱氨酶）基因治疗,SCID,（,严重型联合型免疫缺陷症。第一例接受治疗的是一位,4,岁的女孩。,用带有重组质粒的,“,超级菌,”,分解油（烷烃类）、有机农药污染。,（四）、基因工程在环境保护中的应用,1.,检测水污染,2.,生物降解,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,生物技术（,BT,）的发展在某种程度上是由商品经济,的发展所推动的。,Genentech,公司,1980,年上市后,20,分钟内由,35$,涨到,89$/,股。,（一）、商业投资支持现代生物技术研究,八、,基因工程技术的商业化发展,1980-1983,年，美国成立了,200,多家生物技术公司。,1985,年,400,多家，,1300,多家。,现在,几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。,（二）、基因工程商业化特点,1.,技术密集型,（,1,）产品来源于实验室,Boyer,教授是,Genentech,的副总裁。,（,2,）科学家往往就是公司的领导人,1994,年仅美国的总销售额,40,多亿美元。,1992,年日本,4000,亿日元。,20,世纪末,6000,亿美元。,2.,市场扩张迅速,美国,1993,年,40,多亿美元。,日本,1997,年,5000,多亿日元。,80,年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的,Allelix,生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,3.,投入巨大,4.,风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,我国在,“,七五,”,和,“,八五,”,计划的,10,年间，仅就,“,基因重组人生长激素,”,一个项目的研发就先后投入了近,1.5,亿元人民币的经费。这仅仅是一个仿制型的二类新药，而且又仅仅是制药工艺的研发。长达,10,余年的研发过程，巨额资金的投入，最终也并未获得高质量的,“,国产二类新药,”,。,全世界只有不超过,100,家生物技术公司有,自己的产品,。其中真正盈利的公司很少。,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,已取得的成果中,60%,是医学领域的。,7.,医学生物技术产业进展最快,6.,研究专一、产品专一,8.,专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,5.,产品不断增加,基因工程不是发现，而是创造。,谢谢大家！,再见！,