聚合酶链式反应应用指南

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,聚合酶链式反应的应用指南,PCR,历史演变,PCR,技术简介,PCR,的临床应用,1984,年，,教授发明了具有划时代意义的,PCR,技术。并因此项技术于,1993,年获得诺贝尔化学奖。,1985,年，实验室技术成熟并逐步在临床上应用。,二十世纪九十年代开始，在国内各级医院广泛开展。,2000,年左右，全国开始规范化管理，工作人员需要培训资质，实验室需经过相关机构认证。,PCR历史演变,PCR技术简介,所谓PCR技术，指的是在体外，以某一保守区段为模板，以一对特异性引物进行诱导，以游离的碱基为原料，在Taq酶的催化下，对目的基因迅速扩增的一种分子生物学技术。,一、PCR的概念,1、体外扩增,2、迅速大量扩增,3、灵敏度高,4、特异性高,二、技术特点,变性：使双链DNA变为单链。,退火：使引物和互补模板结合 。,延伸：按53方向以引物为起始点复制,循环次数 DNA的链数,1 2,1,2,2 2,2,4,3 2,3,8,10 2,10,1024,20 2,20,1,048,576,30 2,30,1,073,741,824 10亿,三、PCR技术分类,1、普通PCR检测技术,2、实时荧光定量PCR检测技术,3、高敏感度内标荧光定量PCR检测技术,PCR的临床应用,用于苛养病原菌的鉴定,用于培养周期较长的病原菌检测,用于目前难以或者不能培养病原菌检测,病原菌载量分析,病毒类疾病诊断,需要快速汇报结果的病原菌检测,细菌或肿瘤细胞耐药基因检测,遗传代谢病的分子诊断,（一）、检测适宜人群,1、疑似肝炎患者。,2、需要进行抗病毒治疗效果评估患者。,3、需调整抗肝炎病毒治疗方案者。,4、有肝炎病史且已治愈的拟受孕及孕期女性。,5、有肝炎病史且已治愈的拟母乳喂养及哺乳期妇女。,6、有肝炎病史且已治愈的拟生育男性。,7、肝炎所致肝癌后做过肝移植手术以后患者。,8、血液制品及献血员筛查。,9、转氨酶正常、血清学指标改变后，需要停止药物治疗的患者。,一、乙型肝炎/丙型肝炎检测,（二）、如何检测,1、疑似病人随时抽血进行检测。,2、乙型肝炎患者抗病毒治疗期间，至少每3个月监测一次HBV-DNA水平。,3、对于抗HCV阳性者、考虑接受抗病毒治疗者，在开始治疗前、治疗第4周、第12周，均需要进行HCV-RNA检测。,4、有肝炎病史且已治愈的拟生育男、女性，应在受孕前进行病毒载量检测。,5、有肝炎病史且已治愈的孕期妇女，应在受孕早期、中期及晚期均进行病毒载量检测。,6、有肝炎病史且已治愈的生育后妇女，若想母乳喂养婴儿，应在哺乳期间，定期进行病毒载量检测。,7、献血员及肝移植术后患者应定期进行病毒载量检测。,（三）、标本采集,采集EDTA抗凝（紫帽血常规管）静脉血2-3ml。患者抽血前需要空腹。,注意：标本要及时送到实验室，尤其是丙型肝炎病毒，应于采血后尽快送检。,二、HPV（人类乳头瘤病毒）检测,HPV病毒感染与子宫颈糜烂、尖锐湿疣和宫颈癌等妇科疾病高度相关，其中高危型HPV持续感染时导致宫颈癌的主要原因，而且从感染HPV到发展成为宫颈癌大约需要10年时间。HPV感染所致宫颈癌是唯一一种病因明确，可以早期预防与治疗及彻底根治的肿瘤。,一项调查表明，我国约18%的女性高危型HPV检测阳性，但是25岁以上，有超过80%的人从未做过宫颈癌预防筛查。,（一）检测适宜人群,1、有性生活史的女性,2、有不洁性交史的男性或女性,3、疑似尖锐湿疣患者诊断,4、25岁以上女性健康普查,（二）、如何检测,疑似宫颈癌患者检测通常采用细胞形态学检测（TCT）和病原学检测两种方法。但由于HPV感染早期，细胞形态学改变不显著，单纯依靠TCT结果会造成漏检。采取PCR与反向杂交技术进行检测，是明确诊断的关键手段。,（三）、标本采集,1、,使用窥器暴露宫颈，使用专用的HPV采样刷置于宫颈口，逆时针方向转三圈，并停留十秒。把采样刷放入专用的标本储存瓶里，折断采样刷多余的部份，切勿将采样刷丢掉，以保留足量标本。盖好盖子，标记好送检验室检测。,2、若为尖锐湿疣患者，可以采集疣体组织进行送检。,3、男性患者可以采集尿道拭子送检。,注意：采集HPV标本前三天不要阴道用药或冲洗；避免经期采样，少量血液不影响检测结果；采样前不要进行醋酸或碘液涂抹。,三、性病三项（NG、CT、UU）检测,淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）是引起淋病性尿道炎/阴道炎、非淋病性尿道炎/阴道炎的病原体。常规检测采用细菌培养技术，由于NG抵抗力差，易死亡；CT目前上不能够体外培养；UU培养较为困难，故传统微生物法检测存在困难。,（一）检测适宜人群,1、疑似性病患者诊断,2、有不洁性交史者筛查,3、夫妻双方一方患有性病，另一方筛查,1、男性：清洁尿道后，采用专用拭子插入尿道2cm处，旋转后取出，放置在无菌管中送检。,2、女性：清洁外阴后，采用专用拭子在子宫颈口处采集标本（停留数秒），转入无菌管中送检。,3、尿道炎患者若无明显分泌物，可以采集前段晨尿作为标本送检。,（二）标本采集,四、其他病原体检测,EB检测：依据病原体寄生及复制释放部位，建议采用咽拭子和血液标本同时检测。,CMV检测：依据病原体寄生及复制释放部位，建议采用尿液和血液标本同时检测。,TB检测：根据不同的感染器官，采集相应的标本进行送检。如肺结核查痰液、泌尿系统结核查尿，腹膜结核查腹水，胸腔结核查胸水等。,