肿瘤靶向性纳米转运载体研究

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤靶向性纳米转运载体研究,张振中 教授,郑州大学药学院,河北省石家庄,30/09/2010,现有教职工86人，其中高级职称43人，具有博士学位的教师42人，有双聘院士1人、国家有突出贡献专家1人，省特聘教授3人，另外聘请20余名国内外知名专家为兼职教授。学院设有药学和药物制剂两个专业，拥有一级药学硕士学位授予权、药物化学博士点和药学博士后流动站。药物关键制备技术省部共建教育部重点实验室、,靶向,hTERT,的肝特异性RNAi载体的构建与鉴定,靶向性,转染效率,持续性,“基因治疗”,基因治疗相关文献总量年度变化图,2008年：2071篇（截止到2008/9/1，PubMed）,活性,修饰,RNAi表达系统,协同基因,沉默,hTERT、hEGFR,协同下调,肝特异,性启动子,靶向,hTERT的肝特异性RNAi表达载体系统,CMV、SV40增强子修饰，增强启动子转录活性,apoA-I,启动子,研究内容,靶向,hTERT,基因的siRNA的序列筛选,双基因沉默载体的构建与鉴定,肝,靶向,apoA,-I,启动子的活性修饰,肝特异性,shRNA干扰载体系统的构建与鉴定,双基因沉默载体的构建与鉴定,MTT检测结果,载体pDA-shA-T2的酶切测序结果,载体pDA-shA-T2的酶切测序结果,1 DNA Marker 2. pDA-EGFP :,Vsp,I/,Xba,I 3. pDA-shA-T2:,Vsp,I/,Xba,I,300bp,250bp,RT-PCR结果,1. pDA-shA-T2;.2. pDA-EGFP; 3. pDA-shA-G4,pDA-shA-T2,Western-blot结果,1. pDA-shA-G4,pDA-shA-T2;2. pDA-shA-T2; 3. pDA-EGFP,肝靶向apoA-I启动子的活性修饰,增强子,修饰,修饰方式,基因,突变,基因调控,元件调控,实验流程,同阴性对照,pEA分别,转染肝癌细胞SMMC-7721,pEA-CMV,载体的构建,pEA-SV40,载体的构建,绿色荧光蛋白、,RT-PCR,pEA-CMV载体的酶切测序结果,1. DNA Marker;.2. pEA-CMV:,Nhe,I; 3. pEA :,Nhe,I,1000bp,4600bp,4100bp,pEA-SV40载体的酶切测序结果,1.pEA :,Nhe,I;.2. pEA-SV40:,Nhe,I; 3. DNA Marker,800bp,700bp,5000bp,4100bp,4600bp,GFP荧光表达检测和RT-PCR结果,1. pEA; 2. pEA-CMV; 3. pEA-SV40,1. pEA-SV40; 2. pEA-CMV; 3. pEA,肝特异性shRNA干扰载体系统的构建与鉴定,apoA-I,启动子,CMV增强子活性修饰,Ribozyme,MAZ,结构,shRNAT2,肝特异性,RNAi,表达系统,实验流程,RT-PCR,转染肝癌细胞,SMMC-7721,载体,pDA-shA-,T2-CMV,的构建,载体pDA-shA-T2-CMV的酶切测序结果,1. pDA-shA-T2 :,Bgl,II;.2. pDA-shA-T2-CMV:,Bgl,II; 3. DNA Marker,6000bp,5000bp,RT-PCR结果,1. pDA-shA-T2;.2. pDA-EGFP; 3. pDA-shA-T2-CMV,利用抗体、细胞膜表面受体的专一性作用，将配位子结合在载体上，与目标表面的抗原性识别器发生特异性结合，使药物能准确地作用于目的细胞。,J Nanosci Nanotechol.1( 2004): 235-254,肿瘤基因治疗靶向性：受体介导,新型的基因载体: pegylated immuno-lipopolyplexes,( PILP ),弃上,消消化化,2. PEG化免疫脂质聚合物(PILP)的制备,免疫脂质复合物,（PILP）,DNA/PEI,聚合物,(N/P=10),薄膜振荡法制备空白脂质体,制备PEG化脂质,聚合物(PLP),以不同比例 和,210/1的脂质：DNA摩尔比加入,以SA: biotin=1:1的摩尔比,加入 8314/SA或8D3/SA,室温下孵育 1 h,Tf-PLD制备,稳定的Tf-LPD,冷冻干燥,Tf,空白脂质体,DNA/PEI,+,+,原子力显微镜观察PILP的形态(如图)发现：PILP形态规则，近球形。,图PILP 原子力显微镜图,Fig. Representative atomic force micrographs of PILP,PILP 的抗酶切实验,图1.4免疫脂质复合物（PILP）的酶切保护,Fig. 1.4 Enzyme digestion protection of immuno-lipopolyplexes (PILP). Lane 1: untreated pEGFP; Lane 2: pEGFP incubated with DNAse I; Lane 3: PILP in the absence of DNAse I; Lane 4: PILP incubated with DNAse I; Lane 5: PILP was first incubated with DNAse I and then disassembled with triton X-100 and heparin, and DNA was released,.,8314/EGFP/PILP 在 SMMC-7721 中的表达,图1.5 SMMC-7721细胞中转染效率比较,Fig. 1.5Comparison of transfection efficiency in SMMC-7721 cells. cells were seeded in a 6-well plate and incubated in 1640 medium supplemented with 10% serum at 37. Different wells of cells were transfected with naked plasmid, PEI/DNA polyplexes, pegylated lipopolyplexes (PLP) and pegylated immuno-lipopolyplexes (PILP) at molar ratios of total lipid/DNA of 170/1 at a dose of 3g of DNA per well. HIR MAb 8314 and EGFP plasmid were used. At 48 hours fluorescent microscopy was performed. Transfection efficiency was expressed as mean SE of five measurements.,PILP介导的体内基因表达结果,靶向缩合体的设计,设计靶向配体NGR或RGD多肽能与 缩合体结合形成具有肿瘤靶向性的“复合型”缩合体。,原子力显微镜下复合物平面图,原子力显微镜下复合物立体图,转运载体的构建,设计新型载体材料如糖簇分子，壳聚糖改性分子。降低表面电荷，减少毒性。,胆固醇甲酰-壳聚糖共聚物冬凌草甲素胶束的制备及其细胞,动力学研究,冬凌草甲素,冬凌草甲素（Oridorin，ORI）,不易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙醚等有 机溶剂中。,具有较强的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞都有明显的杀伤与抑制作用。,壳聚糖,药理学应用,医用生物材料,药物载体,两性接枝段共聚物CF-CS-CM的合成研究,2、合成反应,1、壳聚糖的纯化,3、分离纯化,4、鉴定,酸溶碱沉真空干燥,混合溶剂、磁力搅拌、催化剂,透析过硅胶柱,减压蒸发,IR、,1,H-NMR、,13,C-NMR,四步操作,合成反应式,IR,1700cm,-1,3500cm,-1,酰胺,13,C-NMR,=155ppm,酰胺直接与O相连,1,H-NMR,=5.5ppm,双键,合成后的特征,胆固醇甲酰氯的特征,红外图谱,-C=O,N存在,碳谱,9/29/2024,-HN-C=O-0-,氢谱,9/29/2024,-C=C-,CF-CS-CM冬凌草甲素胶束的研究,处方和制备工艺通过包封率载药量指标来选择后得出下面结果。,Your Text Here,单因素考察,质量比=6：1,体积比=4：1,t=30min,T=45,50C,透射电镜TEM测定,空白胶束,载药胶束,MTT试验,对照溶液的IC,50,值分别是载药胶束的2.75与2.72倍。,Group,IC,50,（g/mL）,48,h,72,h,ORI-CF-CS-CM Micelles,1.2520.800,3.3190.530,Oridonin control,3.4430.330,9.0250.370,细胞动力学研究,将110,5,细胞加入载药胶束、冬凌草甲素对照溶液后，培养30、60、120、240和420min后终止细胞对药物的摄取，消化收集细胞。,9/29/2024,摄取动力学,在一定时间内，随着孵育时间延长，细胞内ORI的聚积增加，4h后趋于饱和。,消除动力学,细胞内冬凌草甲素含量-时间曲线图,9/29/2024,细胞消除冬凌草甲素的药动学参数,Parameters,Unit,Value,ORI-CF-CS-CM Micelles,k,h,-1,0.390.01,t,1/2,h,1.800.02,MRT,h,2.590.03,V,L,1.780.24,Cl,10,5,cellsh,-1,0.690.09,AUC,hng/10,5,cells,296.251.79,Oridonin Control,k,h,-1,0.660.01,t,1/2,h,1.050.02,MRT,h,1.520.03,V,L,1.480.01,Cl,10,5,cellsh,-1,0.980.02,AUC,hng/10,5,cells,191.084.24,