高效液相色谱课件

,高 效 液 相 色 谱,（,High Performance Liquid Chromatography,）,基本原理,高效液相色谱法原理,当采用一种或多种测试方法不能直接确定,混合物中特定,或,全部组份,的,组成或含量,时，需要分离后再进行测定。,基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们,在色谱柱中停留时间不同,而完成分离。,主要分离机理：分配、吸附,基本原理,色谱图,(chromatogram),色谱峰,保留时间,(,t,R,),死时间,(t,0,),相对保留时间,(,t,R,),峰面积,(A),峰高,(h),峰宽,(W),T(min,),S(mV,),t,R,t,0,t,R,A,h,色谱图：,是指被分离,组分,的检测信号随时间,分布,的图象,。,色谱峰,：,组分,流经,检测器,时响应的连续,信号,产生的,曲线,，流出曲线上的突起部分。,保留时间,(tR),： 被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的,时间,，也既从进样开始到出现某组分,色谱峰,的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用,tR,表示，常以分（,min,）为时间单位。,死时间,(t0),：从进样到峰出现极大值的时间称为死时间。,基本原理,0,选择性,分离度,色谱柱塔板数,保留因子,基本原理,保留因子,k = (,t,R, t,0,)/t,0,=,t,R,/t,0,分离因子,= k,2,/k,1,流动相组成；,色谱柱；,温度,色谱柱长短；,流动相流量,基本原理,分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：,R 1.0,两峰明显重叠,R = 1.0,两峰达,97.7%,分离,R, 1.5,两峰完全分开,基本原理,不对称度 ,B/A,拖尾因子 ,(B + A)/2A,不对称度与拖尾因子,基本原理,小结,色谱法研究的核心：,选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。,基本原理,固定相重量,流动相重量,色谱理论,1,、塔板理论,目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过,这一方程各参数来研究影响分离的因素。,假设,（,1,）,色谱柱存在多级塔板,;,（,2,）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡,;,基本原理,理论塔板数,N,的计算,基本原理,相邻组分分离度的基本关系式：,分离度：,或,基本原理,1,）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该,方程可以预测具有不同分配系数,K,的两种物质在塔,板数为,n,的色谱柱上分离的情况；,2,）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数,n,，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；,怎样提高色谱柱的理论塔板数,n,，,从而提高色谱柱的效率？,基本原理,2,、速率理论,塔板理论的不足,塔板理论虽然指出了理论板数,n,或理论板高度,H,对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。,Van,Deemter,方程,1956,年,Van,Deemter,提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：,式中：,u,为流动相流动的线速度,基本原理,（,1,）,A,为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散,为填充的不规则因子,dp,固定相颗粒粒径,基本原理,（,2,）,B/u,为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引,起的色谱谱带展宽,B = 2 r D,m,式中：,r,弯曲因子，填充柱,r BC,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,HPLC,的应用,化学键合相色谱法,HPLC,的应用,化学键合相色谱法,流动相,表征溶剂特性的重要参数,溶剂强度,：,溶剂分子与吸附剂的亲合程度，,越大，亲合力约大。,溶解度参数,：,衡量溶剂极性强度的指标，,越大，极性越强。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接受质子或给予质子能力的总和。所以,相近的混合溶剂，它的选择性,不同。,极性参数,P,：,溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷相互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。,粘度,：,HPLC,的应用,化学键合相色谱法,溶剂的选择原则,溶剂具有稳定的化学性质,溶剂的选择与使用的检测器要有相容性,溶剂的粘度要小,溶剂的沸点不能太低,溶剂的纯度要高且价格便宜,HPLC,的应用,液固色谱法,分离机理,以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常数的不同导致不同溶质得以分离。,固定相,极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等,非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等,HPLC,的应用,液固色谱法,流动相,1,、,越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通过混合溶剂来得到,2,、硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。,3,、可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂,HPLC,的应用,液固色谱法,中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等,不同极性取代基的化合物,结构异构体和几何异构体混合物的分离,HPLC,的应用,离子对色谱法,分离机理,将一种或数种与样品离子电荷（,A,+,）,相反的离子,(B,-,),（,称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱,HPLC,的应用,离子对色谱法,固定相、流动相和离子对试剂,固定相：,多为,C,18,，,C,8,反相键合相,流动相：,以水为主的缓冲液，或水,-,甲醇、水,-,乙腈等混合溶剂,离子对试剂：,四丁基铵正离子、十二烷基磺酸根，十六烷基三甲基铵,正离子等,HPLC,的应用,离子色谱法,分离机理,试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：,阳离子交换：,树脂,SO,3-,H,+,+M,+,=,树脂,SO,3-,M,+,+H,+,阴离子交换：,树脂,NR,3+,Cl,-,+X,-,=,树脂,NR,3+,X,-,+,Cl,-,不同的离子与树脂离子的交换能力（,亲和能力,）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。,双柱抑制型：,在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。,单柱非抑制型：,淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好,。,HPLC,的应用,离子色谱法,固定相,离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换树脂小球，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）,流动相,双柱抑制型：,分离阳离子，一般采用无机酸如,HCl,，,HNO3,等；分离阴离子，一般采用,NaOH,、,NaHCO3/NaCO3,。,单柱非抑制型：,分离阳离子，用低浓度的,HCl,，,HNO3,等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等,分析无机阴离子的首选方法；还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。,HPLC,的应用,体积排阻色谱法,分离原理,以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。,V,R,=V,0,+K,D,Vp,0K,D,2000,不溶,排阻色谱,水,分配色谱,(,同系物,),各种,吸附色谱,(,异构物,),各种,不溶,排阻色谱,(,分子大小,),各种,反相液液色谱,各种,可溶但不解离,排阻色谱,水,阳离子交换色谱,(,碱,),缓冲液,可溶且不解离,阴离子交换色谱,(,酸,),缓冲液,2000,可溶离子或非离子,反相离子色谱,缓冲液,HPLC,的发展方向,方法特点,1,，分离效能高,2,，检测灵敏度高,3,，分析速度快,发展方向,1,，高分辨率,2,，高峰容量,3,，高速,