生化实验 设计试验PAGE001

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,生命科学学院,生物化学实验,主讲：刘连芬聊城生命科学学院,E-Mail,：,设计试验,生,物,化,学,实,验,生命科学学院,相关知识背景,生物化学实验,Exit,设计试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,polyacrylamide gel electropHoresis, PAGE,）是以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（,acrylamide. Acr,）和交联剂,N, N-,甲叉双丙烯酰胺（,methylene-bisacrylamide, Bis,）在催化剂过硫酸铵（,ammoniumpersulfate(NH,4,),2,S,2,O,8,简称,AP,）或核黄素,(ribofavn,即,vitamin B,2,),和加速剂,N, N, N, N-,四甲基乙二胺,(N,N,N,N-tetramethyl ethylene diamine,简称,TEMED),的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。,生命科学学院,实验原理,生物化学实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓冲液,PH,均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲液离子成分、,PH,、凝胶总浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分子筛效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电泳中浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。下面就三种物理效应的原理分别加以说明：,Exit,设计试验,生命科学学院,1.,样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种不连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。,（,1,）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在,2,层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排列分开，通常可浓缩样品,300,倍。,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,（,2,）缓冲体系离子成分及,pH,值的不连系性。在三层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（简称,Tris,）及,HCI,。,Tris,的作用是维持溶液的电中性及,PH,值，是缓冲配对离子。,HCI,在任何溶液中均易解离出,Cl-,，在电场中迁移率快，走在最前面成为快离子。电极缓冲液中的甘氨酸（,Gly,）,其,pI,在的电极缓冲液中,易解离出甘氨酸根（,NH,2,CH,2,COO,），而在的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有,0.11%,，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质,pI,在左右在或时均带负电荷向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此氯离子及甘氨酸根沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多个区带。（如图）。,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,（,电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关（,V=mE,）,迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度（即,E,高,m,慢,=E,低,m,快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓度低的区域,即低电导区,电场强度与电导成反比关系：,I=E,式中,E,为电场强度,I,为电流强度,为电导率,E,与电导率成反比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效迁移恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。由于浓缩胶为大孔胶,对样品没有分子筛作用。,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,2.,分子筛效应,:,分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。蛋白质进入的同一孔径的分离胶后。此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解离度增加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过各种血清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时,蛋白分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻力大,移动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。,3.,电荷效应 进入的分离胶中,各种蛋白所带净电荷不同,而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快；反之则慢。因此各种蛋白质按电荷多少,分子量及形状,(,既荷质比,q/r),以一定顺序排成一个个区带。,PAGE,连续体系应用也很广,但无浓缩效应,利用分子筛及电荷效应进行样品分离,条件温和,对生物活性的保持有益。,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,试剂,1,、,1mol/L,盐酸,48.0 mL Tris 36.6g TEMED 0.24 mL,2,、,Acr 28.0g Bis,3,、过硫酸铵,4,、,1mol/L,盐酸,48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL,5,、,Acr 10.0g Bis,6,、蔗糖,7,、电极缓冲液,Tris,克；甘氨酸 克；加水到,1L,用时稀释,10,倍,生命科学学院,实验步骤,设计试验,生物化学实验,一、样品的提取,二、,PAGE,电泳,三,.,结果分析,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,Exit,（,一）、样品的提取,一、过氧化物同功酶的提取,1.,准确称取新鲜材料,3g,，加入,9ml,提取缓冲液（,Tris-HCI,）和少许石英砂，研磨成匀浆。,离心,15min,上清液为可溶性蛋白和同工酶的粗提液。,3.,取上清液，分别加入蔗糖和溴酚蓝。,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,-,垂直板,1.,装胶槽：,（,1,）配,1%,的琼脂糖：用电子天平准确称取,5g,琼脂糖，加水,500ml,然后在电炉上加热至微沸，并不断搅拌，溶液由浑浊变为透明即可。,（,2,）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用铬酸洗净，再用自来水冲洗,2-3,次，最后用蒸馏水冲洗干净，放于相应的支架上直立干燥。（洗净的玻板内面要避免手指触摸，以防沾污）,（,3,）将带有凹槽的玻璃放在凝胶模高一点的孔中，另一平板放于凝胶模有底槽的一边,.,（,4,）将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中（使略低的玻板一侧靠近负极），然后双手以对角线的方式旋紧螺丝帽,.,（,5,）倾斜电泳槽，用滴管吸取少量的,1%,琼脂糖溶液，封好凝胶模板底边和侧边,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,2.,分离胶的配制：,将贮液（除过硫酸铵外）按比例混合成工作液，按比例迅速加入过硫酸铵混匀，不要剧烈搅拌以免带进空气。混合后用注射器将工作液慢慢地、连续地沿管壁注入安放好的电泳板中，分离胶的高度约距矮玻璃板,2cm,，然后立即用注射器在分离胶液面上缓缓加入,3-5,毫米的蒸馏水层，,可以看见凝胶与水之间明显的界面,。切勿使加入的水呈滴状坠入胶液，而使顶部凝胶浓度变稀，改变凝胶孔径。,加水的目的是使凝胶聚合后有一个平整的表面，同时在凝胶聚合过程中使之与空气隔离，减少氧气对聚合的抑制作用。并防止因凝胶弯月面的存在造成电泳后蛋白质区带呈新月形。,加入水层后，让其在电泳时的温度条件下，静止聚合。随着聚合过程的进行，水和凝胶的清楚界面慢慢消失，等到再次看清晰可见的界面时（如图），表明表面的凝胶已聚合，再静置,30,分钟。,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,3.,浓缩胶的制备：,临用时再制备。 将分离胶上的水层，用注射器和滤纸条除去，但不要触及胶面。将浓缩胶贮液按比例混合成工作液，加入浓缩胶液至矮玻璃板平齐，然后静置聚合。看到浓缩胶呈乳白色，表明聚合开始，继续半小时聚合完全。再向电泳槽中灌入电泳缓冲液加至高过矮玻璃板。,生命科学学院,生物化学实验,Exit,设计试验,4.,加样：,(1),垂直板：用微量注射器（或移液枪）取样品溶液,10-25l,，小心地加入到凝胶凹形样品槽底部，因样品比重大于电极缓冲液，因此，样品液自动沉降到胶面上平铺成一层。,5.,电泳：,（,1,）垂直板：先,80V,电泳一段时间,约,60min,后，再,150V,电泳。待指示剂快要到达玻璃板底部时，即快要接近琼脂糖时，关闭电源，停止电泳。,生命科学学院,生物化学实验,5.,取板：,电泳完毕,倒出电极缓冲液,将胶板从电极槽上卸下,平放在实验台上。揭掉橡皮夹套，将两块玻璃板置于自来水龙头下冲洗掉琼脂糖凝胶,设计试验,生命科学学院,生物化学实验,6.,剥胶：,用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬，以防使胶断裂）。用刀片在胶板一端切除一角作为标记。用磨平针尖的兽医用针头吸取无离子水把凝胶从短形玻璃板上剥离，并慢慢把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，即可固定与染色。,设计试验,撬板,剥胶,生命科学学院,生物化学实验,6.,固定,为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需进行固定，方法是：把剥下的凝胶浸泡在,7%,乙酸的水溶液中,15,分钟。,设计试验,固定,生命科学学院,生物化学实验,7.,染色：,同功酶的染色：染色液（,100ml,配方）：称取,0.1 g,联苯胺，加入,10 ml,无水乙醇溶解，再依次加入,HAcNaAc 10ml,，蒸馏水,70ml,。最后加入,3-5,滴,H,2,O,2,。,设计试验,显,色,