生物化学第五章核酸

四川省精品课程 生物化学,第五章 核酸的化学,第一节 概述,第二节 核酸的组成,第三节 DNA的构造,第四节 RNA的构造,第五节 核酸及核苷酸的性质,第六节 核酸的别离提取与纯化,第一节 概 述,一、核酸的发现和研究简史,二、 核酸的分类和分布,一、核酸的发现和研究简史,1869年 Miescher从脓细胞的细胞核中别离出一种含磷酸的有机物，称为核素nuclein,后称为核酸nucleic acid；,年 Avery等成功进展肺炎球菌转化试验；,1953年 Watson和Crick建立了DNA构造的双螺旋模型，说明了基因的构造、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的迅猛开展。,1958年 Crick提出遗传信息传递的中心法那么，,1952年 Hershey等的实验说明32P-DNA可进入噬菌体内，证明DNA是遗传物质。,一、核酸的发现和研究简史,60年代 RNA研究取得大开展操纵子学说，遗传密码，逆转录酶；,70年代 建立DNA重组技术，分子生物技术的兴起；,80年代 RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、“RNA世界假说等等；,90年代 实施人类基因组方案HGP, 开辟了生命科学新纪元。,生命科学进入后基因组时代： 功能基因组学,蛋白质组学,构造基因组学,RNA组学或核糖核酸组学,脱氧核糖核酸DNA:遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。,在真核细胞中，DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。,原核细胞没有明显的细胞核构造，DNA存在于称为类核的构造区。每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状DNA。,二、核酸的分类和分布,二、核酸的分类和分布,核糖核酸RNA：主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。,另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些RNA具生物催化作用ribozyme。,马铃薯块茎病,第二节 核酸的组成,一、核酸的元素组成,组成核酸的根本元素：C、H、O、N、P；,其中P 的含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P 的含量来推算核酸的含量定磷法。,DNA平均含磷量为9.9%，RNA为9.4%。,任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。,二、核酸的根本组成单位-核苷酸,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,碱基,戊糖,核糖,嘌呤,嘧啶,1.核酸完全水解产物,脱氧核糖,Pyrimidines,Cytosine,Thymine,Uracil,C,U,T,Purihes,Adenine,Guanine,A,G,Nitrogenous base,Phosphate,Pentose sugar,HOCH,2,HO,OH,Ribose (in RNA),HOCH,2,H,OH,Doxyribose (in DNA),1嘌呤碱purine, Pu,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,2嘧啶碱purine, Pu,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,尿嘧啶（U）,3核糖,2.糖苷,糖苷键,3.核苷酸,腺嘌呤核苷酸 AMP,脱氧腺嘌呤核苷酸dAMP,O,H,H,P,P,P,P,P,P,P,P,腺嘌呤核苷酸AMP,鸟嘌呤核苷酸GMP,尿嘧啶核苷酸UMP,胞嘧啶核苷酸CMP,脱氧腺嘌呤核苷酸dAMP,脱氧鸟嘌呤核苷酸dGMP,脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTMP,脱氧胞嘧啶核苷酸dCMP,两类核酸分子组成的比较,嘌呤,嘧啶,核糖,磷酸,DNA,A G,C T,脱氧核糖,磷酸,RNA,A G,C U,核糖,磷酸,4.稀有碱基,假尿苷（,）,二氢尿嘧啶（,DHU,）,Am,CH,3,CH,3,H,3,C,m,2,6,G,H,H,5,H,H,5.核苷酸衍生物,a. 能量载体,b. 化学信使,c. 辅酶和辅基的构造成分,d. 食品添加剂,5,-NMP,5,-NDP,5,-NTP,N=,A,、,G,、,C,、,U,5,-dNMP,5,-dNDP,5,-dNTP,N=,A,、,G,、,C,、,T,腺嘌呤核苷酸(,AMP,),二磷酸腺苷(ADP),三,磷酸腺苷(,ATP),a. 能量载体,生物体内最重要的能量转换中间体，含有,两个高能磷酸键,。水解时,可以释放出大量自由能，用于推动生物体内各种需能的生化反应。,ATP,也是一种很好的,磷酰化剂,。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,b. 化学信使,腺苷-3,5-环化-磷酸，或环磷酸腺苷,c. 辅酶和辅基的构造成分,d. 食品添加剂,增味剂是指能增强或改进食品风味的物质。,我国允许使用的氨基酸类型和核苷酸类型增味剂，有5鸟苷酸二钠、5肌苷酸二钠、5呈味核苷酸二钠等6种。,5-肌苷酸,5-鸟苷酸,第三节 DNA的构造,一、DNA的一级构造,二、DNA的二级构造,三、DNA的三级构造,四、DNA与蛋白质复合物的构造,一级构造指DNA分子中脱氧核苷酸的连接方式和排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，也称碱基序列。,DNA：四种脱氧核苷酸按一定顺序以磷酸二酯键相连形成的聚脱氧核苷酸链。,一、DNA的一级构造,5,5,3,3,3,-5,磷酸二酯键,核酸分子中核苷酸之间的共价键,5-磷酸端常用5-P表示,3-羟基端常用3-OH表示。,多聚核苷酸链具有方向性；,规定DNA的书写顺序是5 3 ,一级构造的表示法：,5,3,结构式,线条式,字母式,Chargaff首先注意到,DNA碱基组成的某些规律性，在,1950,年总结出,DNA碱基组成的规律：,腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即,A=T。,鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数相等，即,G=C。,含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，,即：,A+C=G+T。,嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即,A+G=C+T。,二、DNA的二级构造,1 DNA的双螺旋构造(Watson-Crick模型),2 DNA双螺旋构造的稳定因素,3 DNA双螺旋的多态性,1主链：由两条多聚脱氧核糖核苷酸链组成。,两条链沿着同一根假设的中心轴平行盘绕，形成右手双螺旋构造。,螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。,1. DNA的双螺旋构造(Watson-Crick模型),2碱基配对：,嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。,碱基环平面与螺旋轴垂直。,1. DNA的双螺旋构造(Watson-Crick模型),3空间位置和螺旋参数：,螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩即螺旋旋转一圈高度为3.4 nm。,0.34nm,4凹槽：,大沟：较深的凹槽，携带了其他分子识别的信息；,小沟：较浅的凹槽。,大沟,小沟,DNA双螺旋构造的意义,该模型提醒了DNA作为遗传物质的稳定性特征，,最有价值的是确认了碱基配对原那么，这是DNA复制、转录和反转录的分子根底，亦是遗传信息传递和表达的分子根底。,该模型的提出是上世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速开展的基石。,2. 双螺旋构造的稳定因素,氢键,碱基堆积力,c. 磷酸根基团的静电排斥力,d. 碱基分子的内能,竞争,3. DNA双螺旋的多态性,DNA的右手螺旋并不是自然界DNA唯一存在的方式。,右手螺旋构造是在生理盐水溶液中提取的DNA的构造，目前将这种构造称为B-DNA。,1979年，Alexander Rich发现了左手螺旋，称为Z-DNA，另外也有A-DNA的存在。,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,外形,碱基距离,直径nm,螺旋方向,螺距nm,碱基数目,螺旋表面,A型,短粗,0.23,2.55,右手,2.46,11,大小沟,B型,适中,0.34,2.37,右手,3.40,10.4,大小沟,Z-型,细长,0.38,1.84,左手,4.56,12,小沟深,三、DNA的三级构造,DNA的三级构造指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象超螺旋构造。,DNA的超螺旋构造：,(1) 超螺旋DNA的形成,(2) DNA超螺旋构造形成的重要意义,超螺旋,螺旋,大局部原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。,当引进的张力与原先右手螺旋的方向一样时，超螺旋的方向是左手的，称为正超螺旋变紧；,引进张力与原先右手螺旋方向相反时，超螺旋的方向是右手的，称为负超螺旋变松。,正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的，负超螺旋是放松双螺旋后形成的。,超螺旋,局部解链,松弛型,1,5,10,15,20,25,1,5,10,15,20,23,右手旋转拧松两匝后的线形DNA,解链环形,1,5,10,15,20,23,负超螺旋,1,21,4,8,23,16,13,松弛环形,1,15,20,10,5,23,超螺旋的引入就提高了DNA的能量水平，而超螺旋程度的改变介导了DNA构造的变化。即超螺旋多余的能量可能使DNA双股链分开，或局部熔解。这种构造上的变化对DNA分子复制和转录等的启动很重要。,超螺旋的意义,超螺旋可使,DNA,分子形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间 ；,超螺旋的意义,四、DNA与蛋白质复合物的构造,生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白nucleoprotein的形式存在。DNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。,.病毒,.细菌拟核,.真核染色体,动物病毒切面模式图,被膜脂蛋白、碳水化合物,核酸,衣壳蛋白质,病毒粒,突起糖蛋白,噬菌体T2构造,头部,颈圈,尾部,基板,尾丝,尖钉,细菌拟核(nucleoid)的突环构造,平均一个突环含有约40kpDNA,RNA-蛋白质核心,突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成,真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的根本单位是核小体。,核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4五种。H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。,DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状构造。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体。,将近1m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。,真 核 染 色 体,DNA2nm,核小体链 11nm，每个核小体200bp,纤丝 30nm，每圈6个核小体,突环 150nm，每个突环大约75000bp,玫瑰花结 300nm ，6个突环,螺旋圈 700nm，每圈30个玫瑰花,染色体(1400nm),核生物染色体DNA组装不同层次的构造,染色体的四级结构,第四节 RNA的分子构造,一、 RNA一级构造和类别,二、 tRNA 的分子构造,三、 rRNA的分子构造,四、 mRNA的分子构造,一、RNA的一级构造,RNA分子中各核苷之间的连接方式3-5磷酸二酯键和排列顺序叫做RNA的一级构造。,OH,OH,OH,5,3,DNA,RNA,糖,脱氧核糖,核糖,碱基,AGCT，,不含稀有碱基,AGCU，,含稀有碱基,RNA,的类别,信使RNAmRNA：在蛋白质合成中起模板作用；,核糖体RNArRNA：与蛋白质结合构成核糖体,核糖体是蛋白质合成的场所；,转移RNAtRNA：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,1.tRNA的构造,二级构造特征：单链，三叶草叶形，四臂四环,三级构造特征：在二级构造根底上进一步折叠扭曲,形成倒L型,酵母tRNA的二级构造,I,G,C,TC环,可变环,反密码环,D环,反密码子,Ala,氨基酸臂,四茎四环的三叶草形,1氨基酸臂或氨基酸茎：由3-端和5-端碱基组成7对互补碱基对的双螺旋区，富含鸟嘌呤，末端为CpCpA-OH，承受活化的氨基酸。,2二氢尿嘧啶环(D环)：由812个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶。由3-4对碱基组成的双螺旋区与tRNA其余局部相连，这个双螺旋区叫二氢尿嘧啶臂(茎)。,3反密码子环:由 7个核苷酸组成，环中部由3个碱基组成反密码子，反密码子在蛋白质肽合成中能与rRNA上的密码子配对。5对碱基组成的双螺旋区与tRNA分子的其他局部相连。,4额外环，又可变环：由318个核苷酸组成，不同的tRNA具有不同大小的额外环，是tRNA分类的重要指标。,5假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环TC环：由7个核苷酸组成。有5对碱基组成的双螺旋区叫TC臂，由此臂与tRNA的其它局部连接。,tRNA的三级构造,倒写的L字母，在二级构造三叶草形的根底上进一步扭曲、折叠而成的；,氨基酸茎处在倒L的一端并与TC茎形成双股螺旋；倒L的另一端为反密码子环，二氢尿嘧啶茎与反密码子茎形成双螺旋；在倒L的拐弯处是TC环和二氢尿嘧啶环。,整个分子为扁平状，厚度约2nm，两端间直线距离约7nm，以氢键和疏水作用力维持倒L构造。,2. rRNA的分子构造,特征：,单链，螺旋化程度较tRNA低；,与蛋白质组成核糖体后发挥其功能。,5S rRNA， 23S rRNA,原核生物核糖体,50S,30S,34种蛋白质,16S rRNA,21种蛋白质,70S,80S,60S,40S,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,真核生物核糖体,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,5S rRNA的二级结构,3. mRNA的构造,mRNA是以DNA为模板合成的，携带着DNA的遗传信息，故称信使RNA。,mRNA又是蛋白质合成的模板，决定着蛋白质多肽中氨基酸的排列顺序。每一种多肽有一种特定的mRNA负责编码，所以细胞内mRNA种类很多。,mRNA的分子大小不一，相差甚大。,原核与真核细胞的mRNA在构造上的差异,1原核细胞mRNA是多顺反子，即可以编码多条多肽链；真核细胞的mRNA为单顺反子。,2绝大多数真核细胞的mRNA的3-末端具有一段多聚腺苷酸poly(A)，而且不同真核细胞的mRNA的3-末端的poly(A)长短不同；而原核细胞的mRNA一般没有poly(A)。,3真核细胞mRNA 5-末端有一个特殊的5-“帽子构造。“帽子构造和3-末端的poly(A)都有抗核酸外切酶的作用；原核生物mRNA一般没有“帽子构造。,4真核细胞5-“帽子构造的下游和3-poly(A)的上游分别为5-端不编码区和3-端不编码区，二者之间是其编码区。,5-端不编码区和“帽子构造是与核糖体结合的区域，与蛋白质合成的起始有关。至于3-端不编码的功能，目前仍不清楚。原核细胞由于没有“帽子构造，不编码区位于mRNA的两端。,原核与真核细胞的mRNA在构造上的差异,顺反子,顺反子,顺反子,插入顺序,插入顺序,先导区,末端顺序,5,3,原核细胞mRNA的结构特点,AAAAAAA-OH,5,“,帽子,”,Poly,A,3,顺反子,m,7,G-5,ppp-N-3,p,真核细胞mRNA的结构特点,第五节 核酸与核苷酸的理化性质,一、核酸的物理性质,二、核酸的两性解离性质,三、核酸的紫外吸收,四、核酸的变性、复性和分子杂交,五、核酸的熔解温度Tm,六、核酸的颜色反响,DNA,相对分子质量很大，一般在,10,6,10,12,，,制品为白色絮状物。,RNA,相对分子质量较小，一般在,1,10,万，制品为白色粉末。核苷酸也是白色粉末。,DNA,、,RNA,和核苷酸都是极性化合物，易溶于水，难溶于有机溶剂。,一、物理性质：,核酸及核苷酸中碱基上有可解离基团，如胞嘧啶的N3 ，嘌呤的N1和N7 ，可承受质子带正电荷。磷酸基团可进展酸性解离带负电荷。所以，核酸和嘌呤核苷酸、胞苷酸是两性化合物，有等电点。尿嘧啶和胸腺嘧啶不能进展碱性解离，所以它们的核苷酸不是两性化合物。,二、两性解离性质,pK,1, = 0.9,第一磷酸基,pK,3, = 6.2,第二磷酸基,pK,2, = 3.7,含氮环,腺嘌呤核苷酸,pK,1, = 0.7,第一磷酸基,pK,3, = 6.1,第二磷酸基,pK,2, = 3.7,含氮环,烯醇式羟基,鸟嘌呤核苷酸,pK,1, = 0.8,第一磷酸基,pK,3, = 6.3,第二磷酸基,pK,2, = 4.3,含氮环,胞嘧啶核苷酸,pK,1, = 1.0,第一磷酸基,pK,3, = 6.4,第二磷酸基,烯醇式羟基,尿嘧啶核苷酸,pH,离子化程度,核苷酸的解离曲线,DNA和RNA的紫外吸收性质无明显差异。最大吸收峰258nm，最小吸收232nm。,它们的纯度常用A260/A280的比值来判断， 纯DNA溶液的A260/A280为1.8，纯RNA溶液的A260/A280比值为2.0；,样品中假设有蛋白质，那么A260/A280比值要下降。对DNA和RNA制品，可测定其A260，从而计算出含量。,三、紫外吸收性质,三、紫外吸收性质,天然DNA,变性DNA,核苷酸总吸收值,1,2,3,DNA的紫外吸收光谱,220,240,260,280,0.1,0.2,0.3,0.4,波长（nm）,光吸收,1,2,3,四、核酸,的变性、复性和杂交,变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加增色效应,DNA的功能丧失。,复性退火：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋构造，伴有A260减小减色效应,DNA的功能恢复。,在DNA复性过程中,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间,也可以发生在碱基序列局部互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间 ,这种现象称为分子杂交。,利用这一原理，在核酸研究中可引入特制的“探针。,分子杂交,分子杂交,变性（加热）,杂交（缓慢冷却）,复性（缓慢冷却）,探针,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,印迹法,琼脂糖电泳,DNA变性从开场到完全解链是在一个相当窄的温度范围内完成的。定义增色效应到达最大值的50%时的温度称为DNA分子的熔点。用Tm表示。,也就是说，当DNA溶液的温度到达Tm时，已经有50的DNA处于解链状态。Tm的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。,五、DNA,分子的熔点,Poly d(A-T),DNA,Poly d(G-C),某些DNA的Tm值,60,80,100,1 .0,1 .4,1 .2,100%,A,260,t ,0,C,Tm,Tm,Tm,1,2,3,1,2,3,六、核酸的显色反响,地衣酚反响,二苯胺反响,定磷,RAN的含磷量为9.2，DNA的含磷量为9.5，所以按照常规经典定磷法钼蓝反响可以通过检测核酸中的磷而检测核酸的含量。,一般步骤：,1破碎细胞；,2除去蛋白质、脂类、糖类等成分；,3防止剧烈搅拌和振荡；,4除去RNA或DNA；,5抑制相关酶；,6低温操作。,第六节 核酸的别离提取与纯化,DNA的别离纯化,1在破碎细胞的同时，用浓盐酸或十二烷基硫酸钠SDS使DNA与相关的蛋白质解联。,2蛋白酶K消化以使蛋白质局部分解。,3通过缓冲液饱和的苯酚抽提以除去蛋白质。,4通过Rnase消化使RNA降解。,5利用氯仿-异戊醇处理，进一步除去蛋白质。,6参加二倍体积的无水乙醇沉淀DNA。,7琼脂糖凝胶电泳进一步别离和鉴定。,目前在实验室中常常是将细胞匀浆后进展差速离心，制得细胞核、叶绿体、线粒体和核糖体等细胞器和细胞质，然后再从这些细胞器中别离某一些RNA。,爱在双螺旋,复习题,1.某DNA样品含腺嘌呤15.1%按摩尔碱基计，计算其余碱基的百分含量。,2.DNA双螺旋构造是什么时候，由谁提出来的？试述其根本特点。这些特点能解释哪些最重要的生命现象？,3.计算1分子量为3105的双股DNA分子的长度；2这种DNA一分子占有的螺旋圈数。一个互补的脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618,4.名词解释：变性和复性 分子杂交 增色效应,TmChargaff定律,又完毕一章了！,