细胞分离与破碎2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生科院 生物工程系,2024/9/29,生物分离工程,Bioseparation Engineering,侯志敏,第二章,细胞分离与破碎,主 要 内 容,1,.,发酵液预处理,2.,细胞分离,3.,细胞破碎,第一节 发酵液预处理,2024/9/29,5,一、发酵液的一般特性,二、发酵液预处理的目的和要求,三、发酵液预处理的方法,2024/9/29,6,一、发酵液的一般特性,水分含量高（,90-99%,）,产物浓度低（,10%,）,发酵液黏度大，不易过滤,残留培养基成分,含有发酵代谢副产物,发酵液含有色素、毒性物质和热源物质等有机杂质,2024/9/29,7,二、发酵液预处理的目的和要求,（一）目的,改变发酵液特性，加速固液分离,富集分离产物于固相（或液相）,去除部分杂质，减少后续分离负荷,2024/9/29,8,（二）要求,菌体分离,发酵悬浮物的去除,固液悬浮物的去除,蛋白质的去除,重金属离子的去除,色素、毒物和热源物等有机质的去除,改变发酵液特性，利于后续分离工作,调节适宜的,pH,值和温度,杨白劳是怎么死的,?,2024/9/29,10,卤水点豆腐,凝聚原理,黄豆里的蛋白质团粒被水簇拥着不停地运动，聚不到一块儿，形成了“胶体”溶液。点卤用盐卤或石膏，盐卤主要含氯化镁，石膏是硫酸钙，它们能使分散的蛋白质团粒很快地聚集到一块儿，成了白花花的豆腐脑,。,2024/9/29,11,三、发酵液预处理的方法,（一）凝集和絮凝方法,1,、凝集,在,凝聚剂,的作用下，使发酵液中的胶体脱稳并使,粒子,相互凝聚为,1mm,大小块状,絮凝体,的过程。,本质：对初始粒子表面电荷的中和、消除离子表面稳定的,双电荷层,。,2024/9/29,12,胶体双电子层的结构,+,+,+,+,+,+,电荷密度,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,吸附层,扩散层,距固体表面的距离,正电荷分布,负电荷分布,2024/9/29,13,破坏双电荷层的方法,加入具有相反电性的,电解质,，中和胶粒电性，降低双电子层的排斥力，导致胶粒的相互碰撞。,另外，由于电解质在水中的水化作用，会破坏胶粒周围的水化层，促使胶粒碰撞、聚集、沉降。,凝聚剂种类,：,硫酸铝,Al,2(,SO,4,),3,18H,2,O(,明矾,),、,氯化铝,AlCl,3,6H,2,O,、三氯化铁,FeCl,3,6H,2,O,、硫酸亚,铁,FeSO,4,7H,2,O,、石灰、,ZnSO,4,、,MgCO,3,等。,机理,：,A,、破坏双电层，,B,、水解后胶体吸附，,C,、氢键结合等,。,2024/9/29,15,（一）凝集和絮凝方法,2,、絮凝,在高分子,絮凝剂,的作用下，通过,桥架作用,使粒子相互作用形成较大的,絮凝团,的过程。,本质：悬浮粒子与絮凝剂之间的桥架作用,。,2024/9/29,16,絮凝现象与原理,絮凝剂,菌体细胞,废水处理,絮凝剂,是一种能溶于水的高分子聚合物，具长链状结构，其链上含有许多活性功能团，包括带电荷的离子基团和不带电荷的非离子型基团。,絮凝剂种类,：,有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯,乙烯类衍生物；,无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；,天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸,钠、明胶、骨胶、壳多糖等。,机理,：,絮凝剂主要起,中和电荷、桥架和网络,作用,2024/9/29,19,复合型生物絮凝剂,凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。,凝聚,：,投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）,中和胶体的电荷,，使粒子相互聚集成,mm,大小块状凝聚体的过程。,絮凝,：,使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成,10mm,大小絮凝团的过程。其中絮凝剂,主要起架桥作用,。,凝聚：胶体粒子,(10-100nm),中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（,1mm,）,机理：,a,中和粒子表面电荷,b,消除双电层结构,絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程,机理：架桥作用,凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的,分散状态,使其聚集起来,增大体积,以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中,.,2024/9/29,23,（二）加热法,前提：产物的热稳定性高,目的：降低发酵液黏度,加速凝聚作用,除去热变性蛋白,破坏凝胶状胶体稳定性,增加滤饼空隙率,2024/9/29,24,（三）调节,pH,值法,促进絮凝和凝聚作用,释放或稳定产物，防止其氧化、变性或沉淀。,调节,pH,值时应防止过酸或过碱,（四）加水稀释法,提高后续的离心沉降速度,2024/9/29,25,不同,pH,值条件下小球藻,具有不同的悬浮特性,2024/9/29,26,（五）加入助滤剂法,防止滤布或生成的滤饼阻塞而影响过滤。,常用的助滤剂：,纸浆,石棉,活性炭,硅藻土,酸性白土,2024/9/29,27,（六）加吸附剂或盐,吸附细胞,常用的吸附剂有磷酸氢二钠和氯化钙形成的,CaHPO,4,凝胶、氧化铝凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。,􀂄 发酵液中的杂质不仅直接影响产品质量和收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。,􀂄,高价无机离子（,Ca2+,、,Fe2+,等）,􀂄可溶性蛋白质,多糖的去除,有色物质的去除,（七）发酵液的相对纯化,1.,无机离子的去除,Ca,2+,、,Mg,2+,、,Fe,2+,等（如何去除？）,（,1,）,Ca,2+,加草酸钠沉淀,C,2,O,4,Na,2,+ Ca,2+, C,2,O,4,Ca + 2Na,+,（,2,）,Mg,2+,加三聚磷酸钠形成络合物,Na,5,P,3,O,10,+ Mg,2+,Mg Na,5,P,3,O,10,+ 2Na,+,（,3,）,Fe,2+,加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀,4Fe,3+,+ 3K,4,Fe(CN),6,Fe,4,Fe(CN),6,3, + 12K,+,高价无机离子的去除,利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有,等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法,等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。,2,杂蛋白的去除,酶解法,可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。,3,多糖的去除,发酵液中有色物质可能是由于微生物生长,代谢过程分泌,的，也可能是,培养基,（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。,有色物质,如何去除,？,4,有色物质的去除,色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的,吸附法来脱色,最为普遍。,一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。,活性炭可用于油脂、饮料、食品、饮用水的脱色、脱味。,活性炭是一种由含炭材料制成的外观呈黑色，内部孔隙结构发达、比表面积大、吸附能力强的一类微晶质碳素材料。活性炭材料中有大量肉眼看不见的微孔。,活性炭脱色,（,1,）活性碳一般使用温度是,75-80,度比较好；,（,2,）活性炭脱色效果在水中最强，在强极溶剂中使用效果也不错，在非极性溶剂中效果较差；,（,3,）一般情况下，在,pH3-6,条件下使用较好；,（,4,）一般情况下，加入量为,0.13,（,W,V,） ；,（,5,）脱色时间一般为,30-60min,；,注意事项：（,1,）切不可在沸腾的溶液中加入活性炭，那样会有暴沸的危险。（,2,）用活性炭脱色要待固体物质完全溶解后才加入。,活性炭脱色原理和操作,活性炭净化空气,活性炭,除甲醛,固液分离,胞外,上清液,/,滤液,提取生化物质的第一步，分两部分：,胞内,富集细胞,第二节,细胞分离,大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。,浓度可高达每单位体积含,60%,的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含,0.1%,。,粒径的变化可以从直径约为,1um,的微生物，到直径为,1mm,的不溶性物质。,对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。,与过滤设备相比，离心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。,当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为,沉降,。,离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同：,通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体；而过滤可获得水分含量较低的滤饼。,但是，对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离，所以离心往往是很有效的方法。,43,常见的细胞分离方法,重力沉降,离心沉降,过滤,当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：,浮力作用,流体阻力作用,一、颗粒沉降（,Sedimentation,）,什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？,（一）重力沉降,由地球引力作用而发生的颗粒沉降过程，称为重力沉降,当一个球形颗粒放在静止流体中，颗粒密度大于流体密度时，则颗粒将在重力作用下作沉降运动。,设颗粒的初速度为零，则颗粒最初只受重力,F,g,与浮力,F,b,的作用。,重力向下，浮力向上。,F,b,浮力,F,g,重力,根据,沉降作用力,可分为：,重力沉降、离心沉降,（一）重力沉降,当作用于颗粒上的这两个外力之和不等于零时，颗粒将产生加速度。当颗粒开始下沉时，受到流体向上作用的阻力。,F,b,浮力,F,d,阻力,F,g,重力,根据牛顿第二定律,，可得到颗粒,直径为,d,、颗粒密度为,s,的,重力沉降运动基本方程式：,（,1,）球形颗粒的自由沉降速度,重力：,（,a,）,浮力：,（,b,）,t,u,u,0,加速段,匀速段,颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为,自由沉降速度,。达到恒定的沉降速度时，合力为：,阻力：,（,c,）,阻力系数,F,b,浮力,F,d,阻力,F,g,重力,（球形颗粒的自由沉降速度）,（,2,）阻力（曳力）系数（,Drag coefficient,）,与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗粒沉降雷诺数有关，即,注意：其中,d,为颗粒直径，,u,0,为颗粒的沉降速度，,、,分别为流体的密度与粘度。,依靠离心力的作用，使流体中的颗粒产生沉降运动，称为离心沉降。,适于分离两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相物系。,由重力沉降可知，,当颗粒较小时，其沉降速度小,，需要较大的沉降设备。为了提高生产能力，可使用离心沉降。因为离心力可比重力大千倍或万倍。,（二）,离心沉降,颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径向上的分量。,r,1,r,2,A,r,C,B,u,r,u,u,t,颗粒在旋转流体中的运动,（1 ）球形颗粒的离心沉降速度（,u,）,重力场,离心力场,力场强度,重力加速度,g,u,t,2,/R,方向,指向地心,沿旋转半径从中心指向外周,F,g,=mg,作用力,惯性离心力场与重力场的区别,沉降速度,恒定,变化,离心加速度,（离心力场强度）,直径为,d,的球形粒子在流体中作匀速圆周运动，,切线速度为,u,T,；,径向速度,u,r,；,旋转半径为,R,粒子密度为,s,；,流体密度为,惯性离心力（与重力相当）,:,向心力(与重力场中的浮力相当):,阻力(与颗粒径向运动方向相反):,径向受力分析,（指向中心）,（指向中心）,u,r,u,T,u,R,（中心指向外周 ）,三力达到平衡，则：,平衡时颗粒在,径向,上相对于流体的运动速度,u,r,便是此位置上的,离心沉降速度（绝对速度在径向上的分量,）,。,离心沉降速度表达式,重力沉降速度表达式,两者区别在于,加速度的不同，一个是“,u,t,2,/R,”，,一个是“,g,”,。,（,2,）离心分离因数（,K,c,),同一颗粒在同一种介质中的离心沉降速度与重力沉降速度的比值为 ：,比值,K,c,就是粒子所在位置上的惯性离心力场强度与重力场强度之比称为,离心分离因数,。,例如；当旋转半径,R,=0.4m，,切向速度,u,T,=20m/s,时，求分离因数。,分离因数是离心分离设备的重要指标。某些高速离心机分离因数值可高达数十万。旋风或旋液分离器的分离因数一般在52500之间。,表明离心沉降速度是沉降速度的百倍，因此离心沉降设备分离效果远高于重力沉降设备。,原理 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，,在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。,动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。,二、离心分离法,离心力与离心转速的换算,RCF,和,rpm,之间可以相互换算,rpm,revolutions per minute,，每分钟转数，,r/min,RCF,relative centrifugal force,，相对离心力,一般情况下，低速离心时常以转速,“,rpm,”,来表示，高速离心时则以,“,g,”,表示。,通常,离心力,常用,地球引力的倍数,来表示，因而称为,相对离心力,“,RCF,”,。或者用数字乘,“,g,”,来表示，例如,25000g,，则表示相对离心力为,25000,。,相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力,相当于地球重力的倍数,，单位是重力加速度,“,g,”,，此时,“,RCF,”,相对离心力可用下式计算：,RCF = 1.11910,5,(rpm)2 r,由上式可见，只要给出旋转半径,r,，则,RCF,和,rpm,之间可以相互换算。,计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离,“,r,”,不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数,“,g,”,代替每分钟转数,“,rpm,”,，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（,RCFa v,），即离心管中点的离心力。,为便于进行转速和相对离心力之间的换算，,Dole,和,Cotzias,利用,RCF,的计算公式，制作了,转速,“,rpm,”,、相对离心力,“,RCF,”,和旋转半径,“,r,”,三者关系的列线图,。换算时，先在,r,标尺上,(,单位,rpm),取已知转速， 在,RCF,标尺上取已知的离心半径,(,单位,cm),，将这两点间划一条直线，与图中,g,标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。,按速度和离心力：,1.,常速离心机,最大转速,8000rpm(r/min),相对离心力,(RCF)10,4,g,以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；,2.,高速（冷冻）离心机,110,4,-2.510,4,rpm,，相对离心力,10,4,10,5,g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；,3.,超速离心机,转速,2.5-810,4,rpm,，相对离心力,5*10,5,g,；用于,DNA,、,RNA,蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。,（一）离心机的种类与用途,对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，,只要选择好离心速度和时间,，就能达到分离效果。,超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。,1.,差速离心分级,2.,区带离心 （密度梯度离心）,差速区带离心,平衡区带离心,（二）离心分离方法,1.,差速离心,:,工业上最常用的离心分离方法,菌体、细胞,大小,/m,离心力,/g,实验室,工业规模,大肠杆菌,2-4,1500,13000,酵母,2-7,1500,8000,红细胞,6-9,1200,淋巴球,7-12,500,肝细胞,20-30,800,2.,区带离心,多用于生化研究,事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心。,常用密度梯度物质：,蔗糖、,CsCl,、,NaBr,实验室常用的转子,按离心机的作用方式：,斜角式,平抛式,管式,蝶式,螺旋式,多室,（三）离心机的种类与用途,（,1,）斜角式离心机,是一类结构最简单的实验室常用离心机，,指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；,颗粒在角转子中沉降时，,先沿离心力方向撞向离心管，,然后再沿管壁滑向管底，,因此管的一侧会出现颗粒沉积,。,（,1,）斜角式离心机,结构稳定，,可装载较多的样品,使用较高的转速。,加速或减速时，对样品,有搅动。,大容量冷冻离心机,(2,）,平抛式离心机,一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在,3000-6000rpm,。,转子活动管套内的离心管，,静止时垂直挂在转头上，,旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置。,转头结构复杂，最高,转速相对要低,容量也小一些。,平抛式离心机转子,(,）管式离心机,管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在,15000-50000,的高转速下工作。设备简单、操作稳定。,适用范围,细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量,1%,发酵液的分离。,（,3,）管式离心机,(4,）碟片式离心机,碟片式：适合,大规模工业生产,(4,）碟片式离心机,是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。最大处理量达到,300m,3,/h,，常用于大规模的分离过程,。,在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。,适用范围,细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片,5.,螺旋式离心机,三、过滤分离,过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差,P,作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。,过滤介质,:,过滤采用的多孔物质；,滤饼或滤渣,:,被截留的固体物质。,过 滤,filtration,过滤推动力：,悬浮液自身压强差、重力,悬浮液的,外加压力,过滤介质的,抽真空,过滤阻力：,介质阻力,：一般过滤初较明显,滤饼阻力,:,滤饼厚度：随过滤进行而增加,饼特性：颗粒形状、大小。,大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力,。,1.,过滤介质选择,过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。,合理选择过滤介质：,过滤介质所能截留的固体粒子大小,：通常以过滤介质的孔径表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约,10m,，硅藻土为,lm,，超滤膜可小于。,过滤介质的透过性：,是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。,-,织物介质,又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。,-,粒状介质,有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等,。,-,多孔固体介质,如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等,过滤介质,典型过滤设备,：,实验室用抽滤装置,板框压滤机（间歇操作）,转筒真空过滤机（连续操作）,过滤式离心机,过滤设备,(1,）实验室用抽滤装置,