血红蛋白分离和提取

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,3,血红蛋白的提取和分离,一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的,提取和分离，,理解色谱法、电泳法,二、,课题重点：凝胶色谱法的原理和方法,三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理,和色谱柱的装填,思考：,“课题,1-DNA,的粗提取与鉴定” 实验理想的材料是什么？ “课题,3-,血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？,答：鸡的红细胞具有细胞核，,含有,DNA,，便于进行,DNA,的提取，哺乳类动物成熟的红细胞,无细胞核，结构简单,，血红蛋白,含量丰富,便于提取血红蛋白。,一、基础知识,：,（一）,蛋白质分离原理,（二）蛋白质分离的方法,1,）凝胶色谱法：又称分配色谱法,2,）电泳法,（三）缓冲液的作用,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,（,1,）,洗 涤,红 细 胞,（,2,）,释放,血红蛋白,（,3,）,分离,血红蛋白,（,4,）,透析,血红蛋白,1,、样品,处理,3,、纯化,4,、纯度鉴定,2,、粗分离,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度,凝胶色谱法进行纯化,注意事项,蛋白质提取与分离的依据,蛋白质的物理化学性质差异：,1.,分子的形状、大小,2.,电荷性质和多少,3.,溶解度,4.,吸附性质,5.,对其他分子亲和力,1.,凝胶色谱法,一些微小,多孔的球体,（内含许多贯穿的,通道,，具多孔的凝胶就叫,分子筛,）,根据,相对分子质量的大小,分离蛋白质的方法,（,2,）概念：,（,1,）凝胶,3,、原理,：,当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,总结：大分子经过路程短，流动快；,小分子经过路程长，流动慢。,洗脱：,从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。,混合物,上 柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收 集,大分子,收 集,小分子,4,、具体过程,2,凝胶电泳法：,1,）原理：,不同蛋白质的,带电性质,（正电荷或负电荷）,、,电量、,分子形状和大小,不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）,影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,3）常用,电泳,方法,琼脂糖凝胶电泳,聚丙酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,在,测定蛋白质分子量时通常用,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,，,使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量,SDS 带负电荷多的 ，,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，,使蛋白质,迁移速率仅取决于分子大小,。,影响蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,由,弱酸,和相应的,强碱盐,溶解于,水,中。,如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等,缓冲溶液洗脱剂,（,1,）作用：,（,2,）配制：,抵制外界酸碱对溶液,pH,的干扰而,保持,pH,稳定。,（,3,）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？,目的是利用缓冲液,模拟细胞内的,PH,环境,，,保证血红蛋白的,正常结构,和,功能,。,血液组成成分,阅读思考：,血液由,_,和,_,两部分组成。,血细胞中,_,细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是,_,。,该化合物是由,_,和,_,构成的，其中每个亚基中都含有一个能与,O,2,和,CO,2,结合的,_,基团。,血浆,血细胞,红细胞,血红蛋白,2,条,-,肽链,2,条,-,肽链,亚铁血红素,1.,洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的,目的,是什么？,洗涤的,方法,是什么？,洗涤干净,的标志是什么？,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速短时间离心,红细胞,血浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,2.,释放血红蛋白,阅读思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了,哪些物质，有什么用？,目的分析：,蒸馏水,的作用是,_,。,加入,甲苯,的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,滤纸,过滤,脂类物质,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,20mmol/L,磷酸缓冲液,4.,透析血红蛋白,透析的目的是什么？,1mL,1mL,1mL,去除血红蛋白中的小分子杂质,纯化,凝胶色谱法,1.,凝胶色谱柱的制作：,2.,凝胶色谱柱的装填：,教材图,5,19,3.,样品的加入和洗脱,注意：,（,1,）,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀；,凝胶装填时尽量,紧密,；装填时,不能有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,（,2,）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶,装填紧密,3.,样品的加入和洗脱,4.洗脱,缓冲液,凝胶,注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，,否则重新填装。,4.洗脱 、,注意事项,1.,红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2,.,凝胶的预处理,：,沸水浴法，还能除去微生物和气泡,3.,色谱柱的装填：,装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流,。,4.,色谱柱成功标志：,红色区带均匀一致地移动,。,Why？,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,1,、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是,A,、 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对,分子质量较大的蛋白质,B,、 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对,分子质量较大的蛋白质,C,、 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对,分子质量较大的蛋白质,D,、 二者根本无法比较,练习巩固,2.,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,3.,凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是,( ),A.,改变蛋白质分子通过凝胶时的路径,B.,吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度,C.,将酶或细胞固定在凝胶中,D.,与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度,4.,在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是,( ),A.,使酶的活性最高,B.,使蛋白质的活性最高,C.,维持蛋白质所带的电荷,D.,使蛋白质带上电荷,A,C,5,、使用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A,电荷的多少,B,分子的大小,C,肽链的多少,D,分子形状的差异,6.,下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ）,A,可采集猪血作为实验材料,B,用蒸馏水重复洗涤红细胞,C,血红蛋白释放后应低速短时间离心,D,洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,8.,在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是,A,、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱,次序，降低分离效果,B,、气泡阻碍蛋白质的运动,C,、气泡与蛋白质发生化学反应,D,、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密,9.,样品的加入和洗脱的操作不正确的是,A,、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面,B,、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,C,、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,D,、用吸管小心的将,1ml,透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,