细胞分离与纯化课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,体外培养的原理与技术,医科大学组胚教研室,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,四、细胞分离与纯化,从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。,而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必须获取分离开的和尽可能均一的细胞群体。,在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备成,分离（离散）的细胞（,dissociated cell,），,以细胞悬液的形式接种并培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中,分离,(separation or isolation),出成分尽可能单一的细胞用于培养。,细胞分离（,cell separation),指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针对生物化学成分）。,细胞纯化（,cell purification),强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。,通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即,细胞系,（,cell line,）,或,细胞株,。,四、细胞分离与纯化,分离和纯化两概念之间没有截然的界限。许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也常称为,富集（,enrichment,）。,分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与纯化细胞的目的。,培养物中细胞成分是否单一或者,目的细胞,在培养物中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的,重要指标,。,四、细胞分离与纯化,根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动控制的特别是电脑控制的尖端仪器。,从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性而实现的，或者是利用细胞的,物理特性,如密度、体积、电荷等，或者是利用细胞的,生物学特性,如特异性表面标志和功能。,四、细胞分离与纯化,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,3.,根据细胞表面电荷的细胞分离方法,4.,基于不同黏附特性的细胞分离方法,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,6.,利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法,四、细胞分离与纯化,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬液，然后接种并培养，是原代培养的,最常规方法,。,由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培养），在培养的组织块大于,1 mm,3,时，培养过程中,只有,位于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块内部迁移出来的细胞很少。大部分位于植块内部的细胞会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和,O,2,供应，以致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以进行长期体外培养的,主要原因,。,为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织块内部细胞与细胞之间的,“,组织关系,”,解除，将细胞,“,解放,”,，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为,细胞分离（离散）,或,分散（,cell dissociation),。,细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离和纯化的。,将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯化的基础。,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对,目的细胞,一定程度的分离纯化呢？,一方面,，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞的大小不同进行分离纯化；,另一方面,，根据不同组织的,细胞间质,特性不同而实现。,在每一次培养接种时，应尽量先以各种方法使得细胞悬液中,目的细胞,之比例提高。,为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地获得,目的细胞,。,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,（,1,）取材,取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得某一特定培养对象的,关键,。,在切取动物组织块时，要,尽量剔除,所附带的其它组织和残余结构。,（,2,）机械分离过程,在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞分离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。,1),网搓法：,2,）细胞悬液过滤：,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,（,3,）用酶学方法分离纯化,用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是：不同组织的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是,胰蛋白酶,。而结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消化结缔组织、肌肉组织中的间质成分，需要使用,胶原酶,和,其它酶,，胰蛋白酶的消化作用不明显。,（,4,）培养过程中的选择性分离,在体外分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自然纯化的特性。,1),机械刮除法：,2,）选择性酶消化法：,1.,解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的,物理性状,。不同类型细胞的物理性状可能互不相同，这些差异正是部分或完全地分离纯化细胞的依据之一。,基于,物理性状,的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞进行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要,抗原,抗体,、,受体,配体,相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技术具有其自身的优越性。,细胞分离纯化中,最常利用,的物理性状是,细胞的体积,（大小）、,密度,和,表面电荷,。,利用细胞,体积,和,密度,进行分离纯化的技术均基于,沉降作用,。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用沉降技术将其分离开来。,其基本原理是,，悬液中细胞的沉降率与,细胞体积,、,细胞密度,和其周围,介质密度,之差成正比。,应用沉降技术，使之,沉降的,细胞的密度,应该比介质大，而使之,漂浮的,细胞的密度,则应比介质小。因此，实施沉降技术分离纯化细胞的,关键在于,选择,密度梯度形成介质,，故沉降技术也称为,密度梯度（离心）技术,。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,选择,密度梯度形成介质,的,一般原则,是：,所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围；,形成的溶液黏度较低；,具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）；,不损伤细胞或不改变细胞的生物学特性；,离心分离后易于除去；,不妨碍分离组分的分析。,按照上述原则来选择，分离细胞常用的,密度梯度形成介质,有：,（,1,）,牛血清白蛋白,（,bovine serum albumin,，,BSA),（,2,）,聚蔗糖,（,polysucrose,）,（,3,）,泛影酸盐,（,Diatrizoate,）,（,4,）,硅胶颗粒,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,（,1,）,牛血清白蛋白（,bovine serum albumin,，,BSA),由于,BSA,是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但,BSA,黏度很高，分离细胞必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质取代。,（,2,）,聚蔗糖（,poly-sucrose,）,是一种合成的蔗糖聚合物，,商品名,叫,Ficoll,常用的是：,M,r,400 000 Pa,名为,Ficoll,400,。,Ficoll,不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度,Ficoll,溶液的黏度大，可导致细胞凝集，故常以低浓度,Ficoll,和其它物质如泛影酸盐合用以增加溶液的密度。,Ficoll,400,是目前常用的细胞分离介质之一，商品含量为,40,（,w,V,），也可用,Ficoll,干粉来配制。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,（,3,）,泛影酸盐,泛影酸盐,离子强度低，可配制成高密度而低渗透毒性的溶液，而且黏度比,Ficoll,小，很适合密度梯度分离细胞，常与,Ficoll,配合使用。,国外常用商品,Isopaque,或称,Triasil,(sodium,metrizoate,),和,Hypaque,(sodium,diatrizoate,），与,Ficoll,配制的溶液商品名为,Ficoll-Isopaque(Triosil,),或,Ficoll-Hypaque,，泛影酸盐价格较贵。,国内常用造影剂泛影葡胺（,meglumini,diatrizoici,）代替，其商品名为,Urografin,含量通常为,60%,或,75%,其与,Ficoll,配制的溶液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度,1.077,士,0.001,，主要用于人单个核细胞的分离。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,（,4,）,硅胶颗粒,用,聚乙烯毗咯烷酮,（,polyvinylpyrolidone, PVP),包被,硅胶颗粒,，,商品名为,Per,c,oll,。,Per,c,oll,具有以下,优点,：,稳定性很好，可长期保存；,密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度；,在溶液内产生的渗透压很小，故在全部密度范围内能保持等张；,黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时间就可达良好的分离效果；,对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去；,在高速离心（,10,，,000 r/min),时，可形成连续密度梯度；,价廉，分离细胞时用量少。,因此，,Percoll,是一种很优良的分离介质，是现在用于分离多种哺乳动物细胞的,最常用介质之一,。,商品,Percoll,的密度一般为（,1.13,士,0.005,）,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,不同细胞的分离方法：,A.,一步,密度梯度离心法,B.,等,密度梯度离心法,C.,速度沉降法,D.,离心淘析分离技术,血细胞的分离,玫瑰花环细胞的分离,连续,BSA,密度梯度离心法,非连续,BSA,密度梯度离心法,连续,Percoll,密度梯度离心法,非连续,Percoll,密度梯度离心法,低速离心速度沉降法,单位重力沉降法,简单重力沉降法分离白细胞与红细胞,简单重力沉降法分离粒细胞,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,A.,一步密度梯度离心法：,一步密度梯度离心法分离细胞的,依据,是细胞的,密度,和,体积,。,将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分离开来。,一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花环的淋巴细胞。,一步密度梯度法常用的分离介质是：,Ficoll-Hypaque,也可用,Percoll,动物血清,BSA,等。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,B.,等密度梯度离心法,等密度梯度离心法分离细胞的,依据,是细胞的,密度,。,在,等密度连续梯度,分离中，细胞在强离心力的作用下，通过密度逐渐增高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细胞的密度恰好等于梯度介质的密度，因此沉降速度为,0,。,在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不再继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的不同位置上形成区带。,因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的密度。反过来，通过测定细胞停留处梯度介质的密度，可以确定细胞的密度。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,B.,等密度梯度离心法,非连续,密度梯度离心法,分离细胞的原理与,连续,密度梯度离心法,是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。,等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快达到平衡的速度和减少扩散的混合效应。,虽然细胞体积的大小可影响建立平衡的速度，但不影响达到平衡时细胞在梯度上所处的位置。,应用本技术分离细胞常用的梯度介质有,BSA,和,Percoll,。因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用,Percoll,等低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可在低离心力、短时间内达到平衡。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,C.,速度沉降法,在速度沉降中，细胞的体积和密度共同影响细胞的分级分离，但,细胞体积,为主要决定因素。,细胞在单位重力下通过低密度介质（约,1.01 g/ml,）沉降，或在低离心力（通常为,100 g,）作用下通过密度梯度层而沉降，此种细胞分离方法即速度沉降。,前者称为单位重力沉降法，后者即所谓低速离心速度沉降法。,2.,利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,D.,离心淘析分离技术,离心淘析（,centrifugal elutriation,）分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。,3.,根据细胞表面电荷的细胞分离方法,细胞表面均带有电荷，在电场中可向一定的方向泳动，此即细胞电泳。细胞在电场中的泳动速度与其所带电荷密度有关。,在生理,pH,条件下，绝大多数细胞带负电荷，在电场中将向正极泳动，但不同细胞所带负电荷密度不同，故在电场中泳动速度不同，据此可将不同类型的细胞分离开。,电泳分离细胞需要特殊的仪器设备。用于细胞电泳的仪器型号很多，其操作原理也不尽相同。某些仪器仅用于分析，有些则既可用于分析，也可用于制备。,用于制备目的,最常用的细胞电泳技术,是,自由流动电泳,和,密度梯度电泳,。,1.,自由流动电泳分离技术,采用自由流动电泳仪可以进行细胞的连续分离，目前多用的仪器是,EIPhor,VaP,细胞电泳仪。,细胞电泳分离技术已用于人和动物,T,B,淋巴细胞及其它一些细胞的分离，尤其以分离大鼠,T,B,淋巴细胞比较成功。,优缺点：细胞电泳分离技术的优点是所分离的细胞完整无损，活性较高，保持原来的生物学特性，可用于许多方面的研究。其不足之处是分离方法还不太理想，重复性较差，设备复杂且价格昂贵，故一直未能推广应用。,2.,密度梯度电泳分离技术,密度梯度电泳分离法是用聚蔗糖或聚蔗糖蔗糖制成密度梯度进行电泳分离细胞的技术，样品经分离后，不同的细胞群体在此梯度上形成稳定的区带。常用的密度梯度电泳仪是,Buchler,Poly-Prep 200,电泳仪。,密度梯度电泳技术分离细胞方法复杂，设备价格昂贵，现在应用并不广泛。,3.,根据细胞表面电荷的细胞分离方法,4.,基于不同黏附特性的细胞分离方法,黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，是某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一些细胞黏附能力弱或黏附作用慢。,根据这种差异，可用下列方法,分离,或,消除,某些类型的细胞。,A.,差速黏附处理,B.,葡聚糖凝胶,G-10,过柱法,C.,羰基铁粉法,D.,尼龙毛分离法,4.,基于不同黏附特性的细胞分离方法,A.,差速黏附处理,根据不同细胞在玻璃或塑料培养瓶皿表面上黏附能力的差异，将异质性细胞悬液接种在培养瓶皿内，在培养箱内孵育一定时间；使细胞悬液中黏附能力较强的细胞先黏附在瓶皿的壁上，然后收集尚未黏附的细胞或者已经黏附的细胞，再用于种植和培养。这种将黏附较快的细袍与黏附较慢（或无黏附能力）的细胞分开并分别收集的处理过程就称为,差速黏附处理,。,差速黏附处理,常用于分离,细胞悬液中的,成纤维细胞,与其它组织细胞。另外，像,巨噬细胞,之类的具有强黏附能力的细胞也常借此方法而与其它黏附能力较差的细胞相分离。,B.,葡聚糖凝胶,G-10,过柱法,4.,基于不同黏附特性的细胞分离方法,葡聚糖（,sephadex,）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成凝胶。葡聚糖,G-10,凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但也可用来分离细胞。,其分离细胞的,原理,是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶从而将异质性细胞悬液中的具黏附能力的细胞去除。,C.,羰基铁粉法,用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中,具有黏附能力,的细胞。,该法的,基本原理,是：把铁粉加,入,异质性细胞悬液中后，具有黏附活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其上的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。,此法,通常用于,去除免疫细胞悬液中的,单核巨噬细胞,。在此情况下，单核巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。,4.,基于不同黏附特性的细胞分离方法,D.,尼龙毛分离法,尼龙毛,(nylon wool),就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱可从混合白细胞悬液中获得富含,T,淋巴细胞的制剂。,其,基本原理,是：,B,淋巴细胞和单核巨噬细胞易黏附于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，,B,淋巴细胞、浆细胞及单核巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能力的,T,细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获,T,淋巴细胞。,此法,主要用于,从淋巴细胞中,分离,T,淋巴细胞,和,B,淋巴细胞,或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除,T,淋巴细胞。,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体和配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。,从理论上讲，根据表面标志的细胞分离方法应该是获得高纯度细胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证明的确如此。,A.,免疫溶解法,B.,盘化法,C.,凝集素凝集法,D.,玫瑰花环分离法,E.,流式细胞分选术,F.,免疫磁珠分离技术,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,A.,免疫溶解法：,免疫溶解法也称免疫消除法。,当补体存在时,，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的细胞并溶解之。,B.,盘化法（,panning,） ：,是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可吸附于聚苯乙烯塑料表面和,抗原一抗体,或,配体一受体,特异性结合的原理，以聚苯乙烯塑料作为亲和剂的不溶性基质，将抗体（或抗原）、配体（或受体）蛋白吸附于其表面，加上异质性细胞悬液，带有相应表面抗原或表面受体（或配体）的细胞将结合于塑料表面，从而将其从异质性细胞悬液中分离出来（阳性选择）或除去（阴性选择）。,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,C.,凝集素凝集法：,凝集素,(,lectin,),是一类以两价或多价与糖结合的非酶非抗体蛋白质，能凝集具有一个以上相应互补性糖类的细胞或其它物质。细胞表面能与凝集素结合的结构称为,该凝集素的受体,，通常为膜蛋白，但凝集素是对糖特异的，一般只与糖蛋白或多糖的末端非还原糖基反应。几乎所有的细胞都存在一到几种凝集素的受体，而不同类型细胞往往具有不同凝集素受体。,根据细胞表面凝集素受体的不同，可采用不同的凝集素使之凝集而与其它细胞分离开来。,原则上讲，所有细胞，包括细菌细胞及单细胞原生动物，都可以采用不同的凝集素来进行分离纯化。,D.,玫瑰花环分离法：,某些细胞如人,T,淋巴细胞具有异种红细胞的受体，在一定的条件下，,T,淋巴细胞可与红细胞相互识别而结合，形成一个,T,淋巴细胞被数个红细胞围绕的现象，在显微镜下观察宛如一支玫瑰花，故形象地称为玫瑰花环,(rosette),。,E.,流式细胞分选术：,流式细胞仪（,flow,cytometer, FCM,）是一种将,流体喷射技术、激光技术、空气计数、,射线能谱术,及,电子计算机,等技术与,显微荧光光度计,密切结合的仪器，流式细胞术（,flow,cytometry,）就是应用,FCM,检测、分析生物颗粒（包括细胞）的物理和或化学特性或借这些特性进行分离纯化的技术。,FCM,是随着计算机科学、激光技术、流体力学、单克隆抗体制备、定量细胞化学和定量荧光细胞化学等方法和技术的应用而日益完善的，其检测分析对象范围越来越大，如大的免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞以及某些简单的多细胞生物，而且对所有生物都普遍适用，已广泛应用于生命科学的几乎所有分支学科，特别是细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等的研究。,目前，流式细胞术主要用于细胞的定性、定量研究。,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,F.,免疫磁珠分离技术：,免疫磁性微珠（简称免疫磁珠）是以直径几个微米的磁性微珠作为载体，将抗体或抗原结合在此载体上，即成为带有免疫配基的磁性微珠。,磁性微珠是一种人工合成的、含金属的小颗粒，由三部分组成：,核心,是金属小颗粒，,核心的外层,均匀包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），,最外层,是功能基团，如氨基（,NH2,）、羧基（,COOH2,）、羟基（,OH,）等，以便与生物大分子偶联。,免疫磁珠分离技术的基本原理是：,磁珠既可结合蛋白质，又可被磁铁所吸附，经过一定处理将抗体（或抗原）结合在磁珠上，使之成为抗体（或抗原）的载体；磁珠上抗体（或抗原）与特异性抗原（或抗体）物质结合后，形成抗原一抗体磁珠免疫复合物；这种复合物在磁力作用下，发生力学移动，使复合物与其它物质分离，从而达到分离特异性抗原（或抗体）的目的。磁珠与抗体的结合可能只与抗体蛋白的通性和磁珠的特性有关，而与不同个体的个性关系不大，因此磁珠对抗体蛋白的结合具有普遍意义，从而保证其广泛的应用。,5.,利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法,6.,利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法,A.,反复植块法：,反复植块法,(repeated,explantation,),主要是利用不同细胞的迁移能力不同，在植块培养不同时间后，待迁移能力强的细胞（如成纤维细胞）从植块迁移出来以后，而将植块重新种植，使目的细胞再迁移出来，收获并用于进一步培养。目前，这种处理方法主要是针对植块内成纤维细胞与目的细胞向外迁移的速度有较大差别而应用的。,反复植块法的,优点,在于以动物组织植块为材料，细胞在取材过程中受损伤的程度低。但,缺点,是纯化周期长，细胞产量低，细胞纯度难以保证。,B.,有丝分裂抑制剂处理：,有丝分裂抑制剂是一类能通过影响,DNA,复制而抑制细胞分裂的化合物。常用的有阿糖胞苷（,arabinosylcytosine,Ara,-C,）、氟尿嘧啶（,fluorouracil, FU,）等。在体外培养时，给培养液中加入一定量有丝分裂抑制剂，可以抑制所有细胞的分裂活动但不影响细胞的生存和生长。继续培养一定时间，不能进行分裂活动的可分裂细胞将逐渐死亡。于是，培养物中留下相对较纯的有丝分裂后细胞。,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,五、细胞系（株）和细胞克隆,从有机体取得组织、细胞在体外进行培养，原代培养物中一般都包含多种细胞成分。,针对不同的研究目的，需要对培养的细胞进行纯化，以获得成分相对单纯的培养物。,建立细胞系、细胞株和细胞克隆以及细胞周期同步化处理就是不同层次上的细胞纯化过程。,原则上，传代（继代）培养的过程就是细胞系的建立过程。但仅仅经过传代培养，培养物的细胞组成还不能达到完全单一。对某些研究来讲，必须在细胞系的基础上进行克隆化培养，以筛选细胞成分单一的,细胞株,。,（一）细胞系（株）的建立与鉴定,1,、基本概念,将从有机体得到的细胞在体外进行第一次培养，称之为,原代培养,，也叫,初代培养,。如果对原代培养物进行传代培养，此时的培养物就称为,细胞系（,cell line,）,。所以，,细胞系,就是指从原代培养物经传代培养后得来的一群不均一的细胞，可以长期连续传代。,细胞系,是由原先组成原代培养物的所有细胞类型所组成。,细胞系虽然并不强调单一的细胞类型，可以包含来自所取组织中的多种细胞成分，但一般认为应以某种细胞为主，即,主类细胞,应占绝大多数。根据细胞系在体外能否持续传代，可将细胞系分为,有限细胞系,与,无限细胞系,。,五、细胞系（株）和细胞克隆,（,1,）细胞系,（,cell line,）,在体外的生存期有限的细胞系，称之为,有限细胞系,（,finite cell line,）。大多数二倍体细胞为有限细胞系。,在体外可以持续生存，具有无限繁殖能力的细胞系，则称之为,连续细胞系,或,无限细胞系,（,infinite cell line,）。,连续细胞系多为异倍体细胞。有的无限细胞系（如,NIH3T3,RAT-1,等）有持久性增殖能力，即永生性或不死性（,immortality,），但仍保留接触抑制，异体接种无致瘤性。有的无限细胞系不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明其已恶性化，可称之为恶性转化细胞系,(malignant transformed cell line,）。,（一）细胞系（株）的建立与鉴定,1,、基本概念,五、细胞系（株）和细胞克隆,（,1,）细胞系,（,cell line,）,（,2,）细胞株,（,cell strain,）,通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群称为,细胞株,（,cell strain),。,这些特性包括：具有一定,标记染色体,、对某种病毒的,敏感性或抗性,以及具有,特殊的抗原性,等，在以后的培养中,必须持续存在,。,不能继续传代或传代数有限的细胞株，可称为,有限细胞株,(finite cell strain),；可以连续传代的细胞株则称为,连续细胞株,（,continuous cell strain),体外培养的细胞在自然条件或人工诱导下，会在遗传性状上发生变异，形成亚株。由原细胞株再次克隆形成的与原株性状有部分不同的细胞群，称之为,亚株,(,substrain,),。,（一）细胞系（株）的建立与鉴定,1,、基本概念,五、细胞系（株）和细胞克隆,在实际运用中，细胞系与细胞株的概念常常被混为一谈。,其实，这两个概念有明显的区别，,细胞株,（,cell strain,）,强调培养物细胞成分的单一性，所有细胞的遗传、生化等特性完全相同；,细胞系,（,cell,line,）,虽然并不强调细胞的纯度，可以包含多种细胞成分，但主类细胞应占绝大多数。,（一）细胞系（株）的建立与鉴定,1,、基本概念,五、细胞系（株）和细胞克隆,（,2,）细胞株,（,cell strain,）,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,细胞系中的细胞类型是不均一的，通过,细胞克隆（,cell cloning,），,能使培养物从不均一转变为均一，使培养物的遗传可变性减少。,克隆,作为,名词,使用，是指从一个单一母细胞繁殖出来的细胞群体。细胞克隆作为,动词,，是指分离单一细胞并使其繁殖为单一细胞群体的过程。,细胞克隆,又称,单细胞克隆（,single cell cloning,），,即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。,五、细胞系（株）和细胞克隆,原代培养,的细胞和其它未经克隆化的细胞系都具有异质性。,由单一细胞克隆化形成的细胞群体，细胞遗传性状差异减少，生物学性状均一，利于实验研究。,理论上，各种培养细胞都可用来进行克隆培养（,cloning culture,）。但实际上，,原代培养细胞,和,有限细胞系,（二倍体细胞）比较困难，,无限细胞系,、,转化细胞系,和,肿瘤细胞,则比较容易。,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,克隆细胞时，要把细胞先制备成单细胞悬液，再接种在培养瓶上，让细胞呈单个分布独立生长。,适应性和活力较强的细胞能增殖形成细胞小群落。,再取单个细胞群落进行再培养。,1,、克隆培养技术,单细胞分离培养技术有很多种方法。,根据,生长基质,或,培养物,的性质或类型不同，常用的细胞克隆技术分为：,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,1,）稀释铺板法,（,2,）饲养层克隆法,（,3,）胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法,（,4,）琼脂克隆法,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,此方法使用稀释后的低密度细胞悬液，在多孔塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液，使每孔平均含,1,个细胞。,经镜下检测，标记下含单细胞的孔，置培养箱培养。数日后，凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞即为克隆细胞。,（,1,）稀释铺板法,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,1,）主要实验材料：, 培养用液：培养液、消化酶溶液、平衡盐溶液。, 培养用品：包括培养瓶皿、培养板（,96,孔）、吸管、加样器等。, 待克隆细胞：经过原代或传代培养的细胞。,2,）具体操作过程：,消化：, 低密度细胞悬液的制备：, 接种：, 标记与培养：, 分离扩大培养：,（,1,）稀释铺板法,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,在体外培养过程中，细胞的生长增殖除了取决于细胞特性、培养体系和培养条件外，还需要有一定的细胞密度。,单个细胞和密度极低的分散细胞很难存活和增殖。,为了促使刚刚克隆化的极少量细胞生长、增殖，在培养皿中加入能贴壁生长的其它细胞，称之为,“,饲养细胞,(feeder,cell),”,常用的饲养细胞有,成纤维细胞,、,胸腺细胞,和,巨噬细胞,。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,2,）饲养层克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,巨噬细胞,不仅能起饲养作用，还能清除培养体系中的死、伤细胞及其碎片。因饲养细胞制备繁琐，在应用稀释铺板法克隆细胞后，已很少有人再用饲养细胞进行克隆细胞。,但作为生长基质，用以培养某些难培养的细胞尚有应用价值。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,2,）饲养层克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,原代培养细胞容易黏附于,胶原膜层,或,血纤维膜层,等生长基质成分之上。在细胞克隆中，用胶原膜层或血纤维膜层代替饲养细胞，可帮助单个细胞和密度极低的分散细胞黏附和贴壁、存活并逐渐繁殖。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,3,）胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,1,）血纤维蛋白膜层的制备：, 取,0.2,g,凝血酶溶于,100 ml,克隆培养液中，制成,A,液,。, 取,250mg,牛血纤维蛋白原,800mgNaC,l,25mg,柠檬酸钠,溶于,1000 ml,双蒸水中，,制成,B,液,。, 取,B,液,1ml,和,A,液,4 ml,放入培,养皿内尽快混合，几分钟后,即形成透明胶层。,2,）消化、接种和培养待克隆细胞：, 取处于对数生长期的培养物，用胰蛋白酶溶液,消化后制备细胞悬液。, 用克隆培养液稀释细胞悬液，一般以每一培养,器皿内生长,1,10,个克隆的细胞浓度为最适。, 将细胞悬液按所需数目种入铺有生物基质层的,培养器皿内，于,CO,2,培养箱中培养。,每周换培养液,1,次。, 观察并计数克隆之数目。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,3,）胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,琼脂层是一种简单的生长基质层，可帮助细胞贴附生长。,但琼脂中含有,酸性硫酸多糖,，对大多数细胞有一定的抑制作用。,然而，对于有些细胞，特别是病毒转化细胞以及恶性转化细胞却无大影响。,由于这些细胞易于悬浮培养，从而逐步发展了半固体培养基用来克隆悬浮培养细胞的方法。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,4,）琼脂克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,1,）琼脂培养液的制备：,用,Difco,琼脂配成,2,琼脂母液，经高压,蒸汽消毒后贮存备用。,准备进行培养时，将,2,琼脂母液加热融,化后，在室温下降温，然后浸人,45,水,浴中。,将完全培养液也浸于,45,水浴中温育。,取完全培养液和,2%,琼脂液配成含有,0.33%,琼脂的培养液。分装试管内，每管加,2.5 ml,琼脂培养液，仍浸于,45,水浴,中，以保持琼脂呈液化状态。,2,）消化、接种和培养待克隆细胞：,将待克隆细胞用胰蛋白酶溶液消,化，用克隆培养液逐级稀释细胞,悬液。,将稀释后的细胞悬液浸于冰浴中。,在琼脂试管内各加入含有不同细胞,浓度的细胞悬液,0.5,ml,。混合后立,即倾入培养皿内铺平。,放置于,4,条件下使其凝固。然后,置于,CO,培养箱中培养。,培养,1,2d,观察结果，计克隆数。,五、细胞系（株）和细胞克隆,1,、克隆培养技术,（,4,）琼脂克隆法,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,、,影响克隆形成率的因素,接种众多单个分散细胞，经培养后能够增生形成克隆的百分数称,克隆率,或,接种率,(cloning efficiency),，其高低与多种因素有关。,（,1,）接种的细胞密度,克隆形成率与接种细胞的密度有一定的相关性,(,见下表,),，细胞悬液的细胞密度越大，接种时每平方厘米培养皿上接种的细胞越多，克隆的形成率就越低。,为提高克隆形成率，须将细胞悬液稀释成密度为,10,个,ml,，甚至更低，接种的密度也要小。,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,、,影响克隆形成率的因素,（,1,）接种的细胞密度,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,2,）培养基,可用于克隆化的基础培养液（见下表）。,通过选择性培养，选定群落形成效率比较高的培养液作为最适的克隆化培养液。,其中,H,am,培养液,和,F12K,培养液被证明是最好的克隆化培养液,适用于许多细胞类型。,克隆化培养液贮存时久会失去一些有活性的物质如谷氨酰胺等，最好做到每,2-3d,新鲜配制一批，并贮于,-20,。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,克隆化培养液,培养基名称 应用 培养基名称 应用,E,agle,MEM,Ham,培养液,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（,2,）培养基,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,3,）血清,胎牛血清,作培养液中的血清成分，比,小牛血清,优越。,用时可先做克隆形成率试验，选最佳者使用。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,4,）饲养细胞,（,feeder cell,）,在体外培养时，单个细胞和密度极低的分散细胞很难存活和增殖，使用饲养细胞有利于克隆的形成。,饲养细胞也称滋养细胞，是一层经过射线照射伤害处理的、供其它细胞附着的细胞层。饲养细胞受射线照射后，失去分裂能力，但仍存活并有同化营养液的能力，被作克隆的细胞散落在饲养细胞上层与之接触后，饲养细胞能促进克隆细胞的生长。细胞克隆形成后，饲养细胞渐死亡，换液时可被清除。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,5,）激素和生长因子,一些激素和生长因子可促进细胞克隆的形成。,例如，培养液中含,1,10 IU/ml,的胰岛素能促进很多种细胞克隆的形成。地塞米松也能提高人正常胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞、黑色素瘤细胞等的克隆形成率。表皮生长因子可促进角质细胞、成纤维细胞和软骨细胞等生长，推荐使用浓度为,1,20,ng,ml,。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,6,）,CO,2,CO,2,对绝大多数细胞克隆形成率都有提高作用，常用,5,浓度。,对有的细胞，如,人成纤维细胞,和,胶质细胞,克隆时，,2%,的,CO,2,效果可能更好。,HEPES ( 20,mmol,/L,）与,2%,的,CO,2,配合使用能保护细胞免受培养液,pH,值波动的影响。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,7,）适应性生长基质,不同细胞适于在不同的生长基质上生长。,例如，无限细胞系易贴附于塑料瓶壁上，原代培养的细胞易贴附于胶原层或血浆纤维蛋白层生长基质上。,有人证明，用多聚右旋赖氨酸（,poly-D-lysine,）包被培养瓶、皿底壁后，能提高用低血清培养的人成纤维细胞克隆形成率。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,（,7,）适应性生长基质,不同细胞适于在不同的生长基质上生长。,另一种简单的生长基质层是,琼脂层,，常用浓度为,2%,。,琼脂层制备后，可把细胞接种在琼脂层上。,琼脂对一些病毒转化的细胞和恶性细胞生长无大影响。实验证明，恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂（,1.2%,）中的生长与在裸鼠体上的致瘤性有很大一致性。因此测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性的重要指标。,、,影响克隆形成率的因素,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,3,、,克隆的分离,细胞克隆形成后，须将克隆分离出来并进行繁殖。,常用的方法有三种：,（,1,）克隆化环分离法：,在克隆过程中，形成的细胞群落在培养皿上分布不均一，而且群落和群落间没有天然界限。因此，必须人为地给细胞群落创建一个隔离环境，便于进一步分离。,克隆化环就是一种可用来隔离克隆的工具。瓷环、厚壁不锈钢环、尼龙或特氟隆塑料环等都可用作克隆化环。克隆环基底必须是光滑的，内径要恰巧将一整个克隆圈进，而不碰到邻近克隆。,五、细胞系（株）和细胞克隆,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,3,、,克隆的分离,（,2,）射线照射分离法：,将所需的克隆用铅板保护，其余细胞用,X,射线或钴,-60,源照射处理。,（,3,）半固体培养基悬浮培养细胞克隆分离法：,（略）,五、细胞系（株）和细胞克隆,细胞克隆形成后，须将克隆分离出来并进行繁殖。,常用的方法有三种：,（二）细胞克隆,（,cell cloning,）,OVER,