第四章培养基

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 培养基,如何给微生物做饭,?,培养基,（,medium，,复数,media；,或,culture medium,）,是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,一、选用和设计培养基的原则和方法（一）配制培养基的4个原则,1.目的明确,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；,培养目的不同，原料的选择和配比不同；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或,LB,培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。,2.营养协调,微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。,在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：,要素：,含量：,H,2,O,(10,-1,),C,源+能源 ,(10,-2,),N,源 ,(10,-3,),K、Mg,(10,-5,),P、S,(10,-4,),生长因子,(10,-6,),实验室的常用培养基：,细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏1号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌： 查氏合成培养基；,实验室一般培养：普通常用培养基；,遗传研究：成分清楚的合成培养基；,生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；,（1）选择适宜的营养物质,营养物质的浓度适宜；,营养物质之间的配比适宜；,高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。,（2）营养物质浓度及配比合适,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中,碳氮比（,CN）,的影响较大。,link2,发酵生产谷氨酸时：,碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；,碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。,真菌,需,CN,比,较,高,的培养基；,（素食）,细菌,需,CN,比,较,低,的培养基；,（荤食）,NH,3,CO(NH,2,),2, NH,4,NO,3, (NH,4,),2,CO,3, (NH,4,),2,SO,4,含氮量,（,82）,（46） （35） （29.2） （21）,在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。,3.理化适宜,指培养基的,pH,值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。,pH,渗透压和水活度,氧化还原电位,（1）,pH,各大类微生物都有其生长适宜的,pH,范围，,培养基的,pH,必须控制在一定的范围内,，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。,细菌：,pH 7.08.0,放线菌：,pH 7.58.5,酵母菌：,pH 3.86.0,霉菌：,pH 4.05.8,藻类：,pH 6.07.0,原生动物：,pH 6.08.0,嗜极菌（,extremophiles,）,初始,pH,通常培养条件：,在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基,pH,改变的代谢产物，为了维持培养基,pH,的相对恒定，通常要进行,pH,的调节。,pH,的内源调节,pH,的外源调节,pH,的调节,（2）,渗透压和水活度,它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因,水势,（,water potentiality）,的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的,渗透压值,。,渗透压,（,osmotic pressure,）,是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。,与微生物细胞渗透压相等的,等渗溶液,最适宜微生物的生长；,高渗溶液,会使细胞发生质壁分离；,低渗溶液,则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。,是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标,。,它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。,水活度的定量涵义,水活度,即,a,w,（,wateractivity,）,（3）氧化还原电势（,redox,potential,）,又称,氧化还原电位,，,是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。,一般以,E,h,表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，,单位是,V（,伏）,或,mV（,毫伏）,。,不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同,好氧性微生物,：,+0.1伏以上时可正常生长，,以+0.3+0.4伏为宜；,厌氧性微生物,：低于+0.1伏条件下生长；,兼性厌氧微生物,：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，,+0.1伏以下时进行发酵。,氧化还原电位与氧分压和,pH,有关,也受某些微生物代谢产物的影响,增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而,增加,E,h,值；,在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（,Vc，0.1%）、,硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可,降低,E,h,值。,测定氧化还原电势除用,电位计,外，还可在培养基中加入化学指示剂,刃天青,（,resazurin,）,进行间接测定。,在,无氧条件,下呈无色（,E,h,-40,mV,）；,在,有氧条件,下，其颜色与溶液的,pH,相关；,（中性紫色；碱性蓝色；酸性红色）,在,微量氧,时，它呈粉红色。,刃天青,4.经济节约,配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。,（1）以粗代精,对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料,以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。,（2）以“野”代“家”,（3）以废代好,以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。,例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、,乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、,豆制品工业废液、,黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。,工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。,（4）以简代繁,某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。,（5）以氮代朊,以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。,（6）以纤代糖,开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。,（7）以烃代粮,以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。,生产石油蛋白；,将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；,对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。,（8）以“土,”,代“洋”,以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。,（二）4种方法,1.,生态模拟,直接取用这类天然基质（经过灭菌）或模拟这类自然条件，就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相应的微生物。,例如，用肉汤、鱼汁来培养细菌；,用果汁来培养酵母菌；,用润湿的麸皮、米糠培养霉菌；,用米饭或面包来培养根霉；,用肥土来培养放线菌；,用玉米芯来培养脉孢菌（,Neurosporaspp,.,）,等。,2.,参阅文献,（1）直接经验,（2）查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息,3.,精心设计,各项因素的比较或反复试验,优选法或正交试验设计法,4.,试验比较,试验的规模一般都遵循,由定性到定量、,由小而大地,逐步扩大的原则。,生态模拟,参阅文献,精心设计,试验比较,例如，先在培养皿,琼脂平板,上测试某微生物的营养要求,，,然后作,摇瓶培养,（,shake culture,）,试验，,再进行,台式发酵罐,培养试验，,最后才扩大到,试验型发酵罐,和,生产型发酵罐,的规模。,二、培养基的种类,培养基,微生物的菜谱,名目繁多、种类各异,（一）按对培养基成分的了解作分类,天然培养基,组合培养基,半组合培养基,（二）按培养基外观的物理状态作分类,液体培养基,固体培养基,半固体培养基,脱水培养基,（三）按培养基对微生物的功能作分类,选择性培养基,鉴别性培养基,基础培养基,加富培养基,增殖培养基,三、培养基的配制,配料,溶解,调,pH,过滤,分装,灭菌,包扎,摆斜面,贮存,本章小结,1. 微生物的六大营养要素,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,2. 微生物的营养类型,按微生物所需碳源和能源的性质分为四大类：,化能异养微生物（最多）,化能自养微生物,光能异养微生物,光能自养微生物,3. 微生物的营养的方式,有细胞构造的微生物营养方式都是渗透营养型。,单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团移位,4. 设计和配置培养基的原则和方法,4个原则：,目的明确、营养协调、理化适宜和经济节约,4个方法：,生态模拟、查阅文献、精心设计和试验比较,4. 培养基的种类,天然培养基、组合培养基和半组合培养基；,液体培养基、半固体培养基和固体培养基；,基础培养基、选择性培养基和鉴别培养基；,复习思考题,1.,设计表格，比较四种营养物质进入细胞的方式。,2.,对培养基的种类列表表示。,下节课再见了,是指寄生或共生的微生物，,Eg,.,类支原体（,MLO）、,类立克次氏体（,RLO）,和少数寄生真菌等。,难养菌,（,fastidious microorganisms,）,碳氮比（,CN）,比：,碳源含量,氮源含量,碳氮比（,CN,比）,碳源中碳原子的摩尔数,氮源中氮原子的摩尔数,内源调节主要有以下两种方法：,第一种是采用,磷酸缓冲液,进行调节。,pH,的内源调节,通过培养基内在成分所起的调节作用，就是,pH,的内源调节。,调节,K,2,HPO,4,和,KH,2,PO,4,两者浓度比可获得,pH 6.0,7.6,间的一系列稳定的,pH。,K,2,HPO,4,KH,2,PO,4,1,时，溶液的,pH,稳定在,6.8,。,反应原理：,K,2,HPO,4,HCl,KH,2,PO,4,KCl,KH,2,PO,4,KOH,K,2,HPO,4,H,2,O,第二种以,CaCO,3,作“备用碱”,进行调节。,CaCO,3,（,不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、,NaHCO,3,均可用来调节培养基的,pH。,反应是：,pH,的外源调节,这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。,水活度定量涵义为：在同温同压下，,某溶液的蒸汽压,纯水蒸汽压,a,w,该溶液的,百分,相对湿度值,（,ERH，,equilibrium relative humidity,）,a,w,各种微生物生长繁殖范围的,a,w,值在,0.9980.6,之间。,back1,1.,天然培养基,（,complex media,，,undefined media,）,这是指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。,例如，培养多种细菌的,牛肉膏蛋白胨,培养基，,培养酵母菌的,麦芽汁培养基,等。,天然培养基的优点：,营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉 。,缺点：,是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。,2.,组合培养基,（,chemical,defined media,）,又称,合成培养基,或,综合培养基,（,synthetic media,）,，,是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。,例如，,培养细菌的,葡萄糖铵盐培养基,，,培养放线菌的,淀粉硝酸盐培养基,（即,高氏一号培养基,），,培养真菌的,蔗糖硝酸盐培养基,（即,察氏培养基,）等。,组合培养基的优点：,成分精确、重演性高。,缺点：,价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。,3.,半组合培养基,（,semi-defined media,）,又称,半合成培养基,（,semi-synthetic media,）,，,指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。,例如，,培养真菌的,马铃薯蔗糖培养基,等。,1.,液体培养基,（,liquid media,）,一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模的培养微生物。,2.,固体培养基,（,solid media,）,广义：,一类外观呈固体状态的培养基。,狭义：,在液体培养基中加入凝固剂，使之成为固体的培养基。,固体培养基为微生物生长提供一个营养表面，微生物在这表面上可以形成单个菌落。,（1）,固化培养基,（,solidified medium,）,（2）,非可逆性固化培养基,（3）,天然固态培养基,（4）,滤膜,（,membrane filter,）,根据固体的性质又可把它分为4种类型：,固体培养基在科学研究和生产实践上具有广阔的用途，,例如，可用于菌种的分离、鉴定，,菌落计数，检验杂菌，,选种、育种，菌种保藏，,抗生素等生物活性物质的生物测定，,获取大量真菌孢子，,以及用于微生物固体培养和大规模生产等。,3.,半固体培养基,（,semi-solid media,）,例如，,“稀琼脂”（,sloppy agar,），,它在小型容器倒置时不会流出，但在剧烈震荡后则呈破散状态。,指在液体培养基中加入少量的,凝固剂,而配制成的半固体状态培养基，,一般可在液体培养基中加入0.5左右的琼脂制成。,半固体培养基可放入试管中形成“直立柱”，这在微生物学实验中有许多独特的用途，,例如，细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察细菌的运动能力），,微生物趋化性的研究，,厌氧菌的培养、分离和计数，,细菌和酵母菌的菌种保藏，,以及噬菌体效价测定（双层平板法）等。,4.,脱水培养基,（,dehydrated culture media,）,又称,脱水商品培养基,（,dehydrated commercial media）,或,预制干燥培养基,（,pre-fabricated dried culture media）,指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的,现代化培养基,。,（1）固化培养基（,solidified medium,）,例如，加有,12,琼脂（,agar,）,或,512明胶（,gelatin,）,的液体培养基，可制成遇热可融化、冷却后则呈凝固态的用途最广的固化培养基。,常称“固体培养基”，由液体培养基中加入适量的,凝固剂,（,gelling agent,）,而成。,凝固剂必须具有的特点：,a.,不被微生物液化、分解和利用,b.,在微生物生长的范围内保持固体状态,c.,凝固点的温度对微生物无害,d.,不因消毒灭菌的高温处理而破坏,e.,配制方便、价格低廉,f.,透明度好、粘着力强,常用的凝固剂：,琼脂（,agar,）,、,明胶（,gelatin,）,、,海藻酸钠（,alginate,）、,脱乙酰吉兰糖胶（,Gelrite,）、,多聚醇,F127（,pluronic,polyol,F127 ）,等。,（2）,非可逆性固化培养基,Eg,.,血清培养基或无机硅胶（,silica gel,）,培养基等，其中的硅胶平板是专门用于化能自养细菌的分离、纯化等。,指一类一旦凝固后不能再重新融化的固化培养基。,（3）,天然固态培养基,例如，培养真菌用的由麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉等配制成的培养基；,由马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、面包、动物或植物组织直接制备的培养基。,由天然固态基质直接配制成的培养基。,（4）滤膜（,membrane filter,）,是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。若把滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有营养液的纤维素衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。,滤膜主要用于对含菌量很少的水中微生物的过滤、浓缩，然后揭下滤膜，把它放在含适当营养液的衬垫上进行培养，待长出菌落后，可计算出单位水样中的实际含菌量。,1.,基础培养基,（,minimum media,）,在一定条件下含有某类微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，也称为,基本培养基,。,1.,选择性培养基,（,selected media,）,一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于,菌种筛选,等领域。,选择性培养基是19世纪荷兰的,M. W.,Beijerinck,和俄国的,S. N.,Vinogradsky,发明的。,例如，在培养基中加入链霉素、氯霉素可以抑制原核微生物的生长，这种培养基用于分离真菌。,（1）利用该分离对象对某种营养物有一特殊“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物，把它制成一种,加富性选择培养基,（,enriched selected media,）,，,采用了这类,“投其所好”,的策略，就可使原先极少量的筛选对象很快在数量上接近或超过原试样中其他占优势的微生物，从而达到了,富集或增殖,（,enrichment）,的目的。,作为加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，,例如，,纤维素,可富集纤维分解菌；,石蜡油,可富集分解石油的微生物；,较浓的糖液,可富集酵母菌。,（2）利用该分离对象对某种,抑菌物质,所特有的抗性，在筛选培养基中加入这种抑菌物质，经培养后，使原有试样中对此抑制剂表现敏感的优势菌生长大受抑制，原先处于劣势的分离对象大量增殖，最终在数量上占优势。通过这种,“取其所抗”,的办法也可达到富集培养的目的。这种培养基称为,抑制性选择培养基,（,inhibited selected media,）,。,用作抑制它种微生物的选择性抑菌剂有染料（结晶紫等）、抗生素、脱氧胆酸钠和叠氮化钠等。,5.,鉴别性培养基,（,differential media,）,一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。,最常见的鉴别性培养基是,伊红美蓝乳糖培养基,，即,EMB,（Eosin,Methylene,Blue）,培养基,。,它在饮用水、牛奶的大肠菌群（,coliforms,）,数等细菌学检查和在,E.,coli,的遗传学研究工作中有着重要的用途。,