第五章 经典免疫学技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章经典免疫学技术,第一节 沉淀反应,第二节 凝集反应,第三节 补体参与的抗原 抗体反应,第四节 中和反应,第五章经典免疫学技术,第一节 沉淀反应,第二节 凝集反应,第三节 补体参与的抗原 抗体反应,第四节 中和反应,第五章经典免疫学技术,第一节 沉淀反应,根据抗原与抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：,1,溶液中沉淀反应,2,凝胶中沉淀反应,第一节 沉淀反应,根据抗原与抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：,1,溶液中沉淀反应,2,凝胶中沉淀反应,1,溶液中沉淀反应,（,Precipitation reaction in solution,）,是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。,溶液中沉淀反应,盐溶液,抗原,+,抗体,沉淀,20,56,、,pH6,8,抗原：,沉淀原,抗体：,沉淀素,1,溶液中沉淀反应,（,Precipitation reaction in solution,）,（,1,）环状沉淀试验,（,2,）免疫比浊法,（,3,）免疫沉淀技术,（,1,）环状沉淀试验,环状沉淀试验,（,ring precipitation test,）,或毛细管内沉淀反应,（,precipitation in capillary tube,）,（,2,）免疫比浊法,(immunonephelomytry,）,可溶性的抗原、抗体在液相中特异结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浑浊。复合物的量与浊度成正比。,与标准品比较即可计算出样品中的抗原或抗体含量。,免疫沉淀技术,免疫共沉淀,GST pull-down,技术,第一节 沉淀反应,根据抗原与抗体反应的条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：,1,溶液中沉淀反应,2,凝胶中沉淀反应,2,凝胶中沉淀反应,（,Precipitation reaction in gel,）,1968,年,Ouchterlong,发明的。即将抗原抗体溶液放在琼脂凝胶板上的小孔中，使它们彼此对向扩散，在抗原抗体相遇的地方形成沉淀线。,2,凝胶中沉淀反应,此沉淀线的突出,性质,是：特异性抗原抗体不能通过；与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可自由通过此沉淀线。,2,凝胶中沉淀反应,（,1,）单相免疫扩散试验,（,2,）双相免疫扩散试验,（,3,）免疫电泳,（,4,）火箭电泳试验,（,5,）免疫印迹技术,单相免疫扩散试验,双相免疫扩散试验,（,3,）免疫电泳,（,immunoelectrophoresis,）,（,4,）火箭电泳试验,又称,Western blotting,电泳,印渍及检测,（,5,）免疫印渍技术,（,immunoblotting,）,免疫印渍,第一节 沉淀反应,第二节 凝集反应,第三节 补体参与的抗原 抗体反应,第四节 中和反应,第五章经典免疫学技术,第二节 凝集反应,1,直接凝集反应,2,间接凝集反应,3,桥梁凝集反应,4,共同凝集反应,第二节 凝集反应,1,直接凝集反应,2,间接凝集反应,3,桥梁凝集反应,4,共同凝集反应,1,直接凝集反应,（,direct agglutination,）,是将细菌或红细胞与其相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。,1,直接凝集反应,（,1,）微生物凝集反应,如诊断伤寒病的肥达氏,（,Widal reaction,）反应,（,2,）同种红细胞凝集反应,如检查血型的血细胞凝集现象,第二节 凝集反应,1,直接凝集反应,2,间接凝集反应,3,桥梁凝集反应,4,共同凝集反应,2,间接凝集反应,（,indirect agglutination,）,用可溶性抗原（或抗体）包被在一种与免疫无关的、具一定大小的不溶性颗粒（即载体颗粒，如：乳胶颗粒或红细胞）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有适宜电解质存在的条件下，结合产生的凝集现象。,2,间接凝集反应,正向间接凝集反应：将抗原先吸附在载体表面，然后与相应抗体结合产生的凝集反应。,反向间接凝集反应：将特异性抗体先吸附在载体表面，然后与相应抗原结合产生的凝集反应。,既可检测抗原，也可检测抗体；,方法简便、敏感。,正向间接凝集反应,此方法对检测微量抗原具有较高的敏感性。而且由于相关病原体的抗原成分一般情况下比血清抗体出现早，所以可用于某些传染病如钩端螺旋体抗原和乙型肝炎表面抗原,(HBsAg),或原发性肝癌,AFP,的检测等。,反向间接凝集反应,第二节 凝集反应,1,直接凝集反应,2,间接凝集反应,3,桥梁凝集反应,4,共同凝集反应,3,桥梁凝集反应,又称,Coombs,抗球蛋白试验。此试验用于检测不完全抗体。,第二节 凝集反应,1,直接凝集反应,2,间接凝集反应,3,桥梁凝集反应,4,共同凝集反应,4,共同凝集反应,又称协同凝集反应。指由两种颗粒成分相互作用而发生的凝集反应。,4,共同凝集反应,（,1,）细菌抗体与携带蛋白,A,的金黄色葡萄球菌,Cowan ,系致敏，即通过其,IgG,的,Fc,段与蛋白,A,结合，再与相应细菌发生凝集反应。,（,2,）玫瑰花结试验：主要用于研究各种淋巴细胞特性。,E,花环形成示意图,B,细胞,EA,、,EAC,玫瑰花环形成示意图,淋巴细胞的分离,玫瑰花结,淋巴细胞与红细胞形成玫瑰花结的主要模式,玫瑰花结的类型,红细胞的类型及处理,淋巴细胞类型,E,花结,绵羊红细胞,T,、,50%NK,EA,花结,抗体致敏的红细胞,B,、,T,、,NK,、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞,EAC,花结,补体致敏的红细胞,B,第一节 沉淀反应,第二节 凝集反应,第三节 补体参与的抗原 抗体反应,第四节 中和反应,第五章经典免疫学技术,第三节补体参与的抗原抗体反应,1,补体参与直接的抗原抗体反应,2,补体参与间接的抗原抗体反应,第三节补体参与的抗原抗体反应,1,补体参与直接的抗原抗体反应,2,补体参与间接的抗原抗体反应,1,补体参与直接的抗原抗体反应,（,1,）溶血反应,（,2,）溶菌反应,（,1,）溶血反应,（,hemolytic assay,）,溶血反应常作为是否存在游离补体的指示系统。,（,1,）溶血反应,1942,年,Rutstein,和,Walker,根据补体能使兔抗羊红细胞抗体致敏的羊红细胞发生溶血的特点，建立了测定血清中总补体活性的方法（即,50%,溶血反应,CH,50,测定方法）,（,2,）溶菌反应,溶菌反应常作为某血清中是否存在相应抗体的检测方法。,第三节补体参与的抗原抗体反应,1,补体参与直接的抗原抗体反应,2,补体参与间接的抗原抗体反应,2,补体参与间接的抗原抗体反应,（,1,）补体结合试验,（,2,）被动红细胞溶解试验,（,3,）溶血空斑试验,（,1,）补体结合试验,（,complement fixation test,）,1901,年由,Bordet,和,Gengou,首先应用溶血反应作为指示系统，建立的检测抗原抗体反应的方法。,补体结合试验原理,（,2,）被动红细胞溶解试验,即吸附抗原的红细胞在有相应抗体和补体存在时，出现红细胞溶解反应。,抗原致敏红细胞,加入待测血清和补体,判断结果,（阳性对照：加入相应抗体和补体）,（,3,）溶血空斑试验,是测定,B,淋巴细胞产生和分泌抗体功能的一种体外试验方法。,溶血空斑试验,第一节 沉淀反应,第二节 凝集反应,第三节 补体参与的抗原 抗体反应,第四节 中和反应,第五章经典免疫学技术,第四节 中和反应,中和反应（,neutralization,）：,是免疫学和病毒学中常用于检测中和抗体是否存在及其效价的试验，反映抗体中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。,中和抗体：病原微生物侵入机体后，使之产生能中和相应微生物及其毒性产物（毒素），从而使病原微生物丧失感染能力或毒力的抗体。,（中和抗体：能与病毒结合，使其失去感染力的抗体。,抗毒素：能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体。）,中和反应的原理,即将被检血清与病原微生物混合，经适当时间作用后，接种于宿主系统（包括动物、鸡胚或培养细胞），按照对其产生的保护效果的差异，可判断该微生物或毒素是否已被中和，并计算出中和的程度（中和指数），即代表中和抗体效价。,中和反应的特点：,（,1,）检测机体内是否存在中和抗体以及中和抗体的效价，直接反应机体抗病毒的能力，有利于临床诊断；,（,2,）中和抗体在体内存留时间一般较长，可用于流行病学调查；,（,3,）中和反应有严格的种、型特异性，可对分离的病毒进行准确的分类鉴定。,缺点,：操作麻烦，试验时间较长。,中和反应的类型：,1,终点法中和反应,2,蚀斑减少法中和反应,1,终点法中和反应,根据滴定被血清中和后的残余毒力，来判断血清中中和抗体的效价。,（,1,）固定病毒稀释血清法,（,2,）固定血清稀释病毒法,（,1,）固定病毒稀释血清法,先固定病毒的毒价，再与等量的递进稀释的待测血清混合，置,37 1,小时，每一稀释度接种,3,6,只动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的存活数和死亡数（或培养细胞破坏程度），然后计算其半数保护率（,PD50,），即该血清的中和效价。,（,2,）固定血清稀释病毒法,将病毒原液作,10,倍递进稀释，分别与等量正常血清（对照组）、待测血清（试验组）混合，置,37 1,小时，每一稀释度接种,3,6,只动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的死亡数（或培养细胞破坏程度），然后计算其半数致死率（,LD,50,）和中和指数。,（,2,）固定血清稀释病毒法,中和指数,=,试验组,LD,50,/,对照组,LD,50,2,蚀斑减少法中和反应,是血清中和抗体的一种较为敏感的检测方法，抗体效价是以蚀斑数减少,50,的血清稀释度表示。,试验使用定量的病毒,(,100PFU,),与不同稀释度的等量血清混合后感染细胞，再与营养琼脂混合后铺板并培养，数天后统计蚀斑数。,