环境微生物学第六章

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 微生物的遗传与变异,“种瓜得瓜，种豆得豆”,“龙生龙，凤生凤”,“,老鼠生来会打洞,”,说明什么问题,?,遗传现象,“一龙生九子，九子各不同,”,又说明什么问题,?,变异现象,亲代的性状在子代表现出来，使子代与亲代有相似的现象，叫遗传。从分子水平上讲，遗传就是遗传信息的复制和表达。,生物亲代与子代之间，子代个体之间有差异的现象，主要体现在形态和生理性状。从分子水平讲，是遗传信息发生了变化。,遗传,（,heredity,）,变异,（,variation,）,遗传型,生物体所携带的全部遗传因子或基因的总称。,表型,具有一定遗传性的个体在特定的外界环境中通过生长发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和。,有些基因结构未发生变化仅表型改变不是变异，只能称适应或饰变（,modification,）。变异是基因结构发生变化，而且往往是不可逆的变化，此变化可以遗传给子代形成新的品种。遗传是相对的，变异是绝对的；遗传中有变异，变异中有遗传。,第一节 微生物的遗传,一、,DNA,是遗传物质,三个经典实验证明了核酸,(DNA,和,RNA),是遗传物质基础。,1.,肺炎链球菌的转化现象,2.,噬菌体感染实验,3.,植物病毒重建实验,一、遗传变异的物质基础,加,S,菌,DNA,加,S,菌,DNA,及,DNA,酶以外的酶,加,S,菌的,DNA,和,DNA,酶,加,S,菌的,RNA,加,S,菌的蛋白质,加,S,菌的荚膜多糖,活R菌,长出,S,菌,只有,R,菌,1944,年,O.T.Avery,、,C.M.MacLeod,和,M,。,McCarty,从热死,S,型,S. pneumoniae,中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有,S,型细菌的,DNA,才能将,S. pneumoniae,的,R,型转化为,S,型。且,DNA,纯度越高，转化效率也越高。说明,S,型菌株转移给,R,型菌株的是遗传因子,即,DNA,。,32,P,标记噬菌体,DNA,35,S,标记噬菌体的蛋白质外壳,大多数噬菌体的,DNA,存在于细菌中，而外壳留在上清液中。,噬菌体感染实验,植物病毒重建实验,证明了,RNA,为遗传物质,1956,，,Fraenkel-conrat,用含有,RNA,的,TMV,和,HRV,进行了,植物病毒重建实验。,证明杂种病毒的蛋白质外壳来自,病毒1，而非病毒2,生化提取分别获得含,RNA,的烟草花叶病,毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2,(,霍氏车前花叶病毒,),杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现,为病毒2，而非病毒1,遗传物质是核酸（,RNA）,而非蛋白质,核外,DNA,的种类,核外染色体,真核生物的“质粒”,原核生物的质粒,线粒体,细胞质基因叶绿体,（质体）中心体,卡巴颗粒,酵母菌的,2,m,质粒,F,因子,R,因子,Col,质粒,Ti,质粒,巨大质粒,降解性质粒,卡巴颗粒,(1) DNA,由,2,条反平行的脱氧多核苷酸链构成，两条链绕同一中心轴盘旋而形成右手双螺旋。,(2),每条主链由磷酸和脱氧核糖相间连接而成，位于螺旋外侧，碱基位于螺旋的内侧，碱基平面与螺旋中心轴垂直，螺旋表面有,2,条螺旋形的凹槽：大沟和小沟。,(3),双螺旋的直径是,2nm,，,沿中心轴每个螺旋周期有,10,个核苷酸对，螺距为,3.4nm,，,碱基对之间的距离为,0.34nm,。,(4),两链间的碱基以氢键互相配对。,A,与,T,配，有,2,个氢键；,G,与,C,配，有,3,个氢键。,小沟,大沟,1.0 nm,二、,DNA,的结构与复制,脱氧,核糖,碱基,磷酸,A,G,C,T,基本单位脱氧核苷酸,A,G,C,T,腺嘌呤脱氧核苷酸,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,脱氧核苷酸的种类,连 接,A,T,G,C,A,T,G,C,DNA,的化学结构示意图,要点,(1) DNA,由,2,条反平行的脱氧多核苷酸链构成，两条链绕同一中心轴盘旋而形成右手双螺旋。,(2),每条主链由磷酸和脱氧核糖相间连接而成，位于螺旋外侧，碱基位于螺旋的内侧，碱基平面与螺旋中心轴垂直，螺旋表面有,2,条螺旋形的凹槽：大沟和小沟。,(3),双螺旋的直径是,2nm,，,沿中心轴每个螺旋周期有,10,个核苷酸对，螺距为,3.4nm,，,碱基对之间的距离为,0.34nm,。,(4),两链间的碱基以氢键互相配对。,A,与,T,配，有,2,个氢键；,G,与,C,配，有,3,个氢键。,双,螺旋结构有,A,、,B,、,Z,三种类型。,A,型螺旋比,B,型螺旋拧得紧一些。,Z,型螺旋是左手螺旋。,但目前公认,B,型螺旋是最接近天然状态的,DNA,结构，也是细胞内,DNA,的主要存在形式。,特定的种或菌株的,DNA,分子，其,碱基顺序固定不变,，保证了,遗传的稳定性,。,一旦,DNA,的个别部位发生了碱基排列顺序的变化,都会导致死亡或发生遗传性状的改变。例如,:,在特定部位丢掉一个或一小段碱基,增加一个或一小段碱基,改变了,DNA,链的长短和碱基顺序,a.,氢键,。两条链间碱基的相互作用，,A,与,T,间两个氢键，,G,与,C,间三个氢键，虽然氢键是一个弱键，但,DNA,中氢键数量大，所以氢键是,比较重要的因素,。,b.,碱基堆积力,(base stacking action),。,是,一条链上相邻两个平行碱基环间的相互作用,，这是来自芳香族碱基,键电子之间的相互作用，是维持,DNA,双螺旋稳定的,主要因素,。碱基堆积使双螺旋内部形成疏水核心，从而有利于碱基间形成氢键。,c.,离子键。,DNA,分子中磷酸基团在生理条件下解离，使,DNA,成为一种多阴离子，这有利于与带正电荷的组蛋白或介质中的阳离子间形成静电作用，能,减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定,。,DNA,双螺旋结构的稳定因素,（,3,）三股螺旋结构的,DNA,a.,科学家在实验室设计并合成由,15-25,个核苷酸组成的短链反义核酸，这些反义核酸可被绑到,DNA,中形成三股螺旋的,DNA,。,b. 1992,年我国科学家首先发现具有三股螺旋的天然,DNA,，,已被国际公认。,3,、,DNA,的,三级结构,超螺旋,DNA,的三级结构是指,双螺旋基础上分子的进一步扭曲或再次螺旋所形成的构象。,其中，超螺旋,(,superhelix,),是最常见也是研究最多的,DNA,三级结构。,细胞内的,DNA,主要以超螺旋形式存在。,当超螺旋,DNA,的一条链上出现一个缺口时，超螺旋结构就会松开，而形成开环型结构。,a.,为直线型双螺旋结构；,b.,为开环型结构；,c.,为闭环型,超螺旋结构,(,一,) DNA,的存在形式,1,、,真核生物,：真核生物,(,人、高等动物、植物、真菌、藻类及原生动物,),的,DNA,和组蛋白等,组成染色体,，少的几个，多的几十或更多，染色体,呈丝状结构,，细胞内所有染色体,由核膜包裹成一个细胞核,。,2,、,原核微生物,：原核微生物的,DNA,只与很少量的蛋白质结合，也没有核膜包裹，单纯由一条,DNA,细丝构成环状的染色体，位于细胞的中央，高度折叠形成具有空间结构的一个,核区,。,（二）、基因及遗传信息传递,基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。它是,DNA,分子上一个具有特定碱基顺序，即核苷酸顺序的片断。,(2),分类,(,按功能分,),(a),结构基因：编码蛋白质或酶的结构，控制蛋白质或酶的合成，但,tRNA,和,rRNA,基因不编码蛋白质；,如，大肠杆菌三种有关利用乳糖的酶是由三个结构基因决定的；,(b),操纵基因或操纵区：它的功能像,“,开关,”,，,操纵三个结构基因,的表达；,(c),调节基因，它是,控制结构基因,的。由调节基因决定一种阻抑蛋白封闭操纵区的作用，使三个结构基因都不能表达，阻抑了酶的合成。,当培养基中有乳糖时阻抑蛋白失活，不能封闭操纵基因，因而结构基因得以表达，合成能利用乳糖的酶。,o.,操纵基因；,a,b,c,结构基因；,R.,调节基因；,L.,乳糖；,A. B. C,蛋白质,(,三,),、,DNA,的复制,半保留复制,以亲代,DNA,分子的两条链为模板合成各自的互补链，形成两个子代的,DNA,分子的过程称为复制，这个过程是半保留复制即合成新的,DNA,分子时，子代,DNA,的一条链来自亲代，另一条链为新合成的互补链。,首先,是,DNA,分子中的两条互补的多核苷酸链之间的氢键断裂，彼此分开成两条单链，,然后,各自以原有的多核苷酸链为模板，根据碱基配对的原则吸收细胞中游离的核苷酸，按照原有链上的碱基排列顺序，各自合成出一条新的互补的多核苷酸链，新合成的一条多核苷酸链和原有的多核苷酸链又可以氢键连接成新的双螺旋结构。,半保留复制,DNA,两条链都作为模板合成两条新链,三、,DNA,的变性和复性,核酸变性：是指核酸双螺旋结构解开，氢键断裂，但并不涉及核苷酸间磷酸二酯键的断裂。,DNA,的复性：变性,DNA,在适当条件下，又可使两条彼此分离的链重新缔合而形成双螺旋结构，这一过程又称为退火。复性后的,DNA,可基本恢复一系列的理化性质，生物学活性也可得到部分恢复。,引起变性的,外部因素,：加热、极端的,pH,、,有机溶剂、尿素和甲硫胺等。它们都能破坏氢键、疏水键、碱基堆积力，从而破坏双螺旋。,DNA,的变性可发生在一个很窄的温度范围内。,DNA,的变性和复,性图,图,6-7 DNA,的解链曲线,经加热成单链,DNA,双链,DNA,重新形成,图,6-8,变性,DNA,重新形成双链,DNA,的过程,缓慢冷却,单链,DNA,熔解,DNA,双链,DNA,T,m,=92.6,温度,/,DNA,变性和蛋白质变性的区别？,三、,RNA,1,、,DNA,与,RNA,的区别,(1) RNA,的戊糖为核糖，,DNA,的为脱氧核糖；,(2) RNA,的四种碱基中没有胸腺嘧啶,(T),，,以尿嘧啶,(,uracil,简称,U),代替；即为,A,、,C,、,G,、,U,；,(3) RNA,是单链自身回折结构；碱基配对：,A,U,，,G,C,。,2,、,RNA,的种类,(1),mRNA,(messenger RNA),：,约占总,RNA,量的,5,。其上带有指导氨基酸的信息密码,(,三联密码子,),，,作用,是,翻译氨基酸,，将遗传信息,从,DNA,传到蛋白质,，在肽链合成中起,决定氨基酸排列顺序,的,模板,作用。,(2),tRNA,(transfer RNA),：,约占总,RNA,的,15,，相对分子量较小，游离于胞质中。其上有和,mRNA,互补的反密码子，能,识别氨基酸,及,识别,mRNA,上的密码子,，在,tRNA,-,氨基酸合成酶的作用下,传递氨基酸,(,实际上是起翻译作用,),。,(3),rRNA,(ribosomal RNA),：,约占总,RNA,量的,80,，相对分子量较高，是,核糖体的组成成分,(,占,60,左右,),，核糖体是蛋白质合成,(,翻译,),的场所。,(4),反义,RNA,：,能与,DNA,的碱基互补，并能阻止、干扰复制转录和翻译的短小的,RNA,。,第二位置,第,一,位,置,mRNA,的,5,端,U,U,C,A,G,U,C,A,G,第,三,位,置,mRNA,的,3,端,UUU,苯丙氨酸,UUC,苯丙氨酸,UUA,亮氨酸,UUG,亮氨酸,UCU,丝氨酸,UCC,丝氨酸,UCA,丝氨酸,UCG,丝氨酸,UAU,酪氨酸,UAC,酪氨酸,UAA,终止,UAG,终止,UGU,半胱氨酸,UGC,半胱氨酸,UGA,终止,UGG,色氨酸,C,CUU,亮氨酸,CUC,亮氨酸,CUA,亮氨酸,CUG,亮氨酸,CCU,脯氨酸,CCC,脯氨酸,CCA,脯氨酸,CCG,脯氨酸,CAU,组氨酸,CAC,组氨酸,CAA,谷氨酰氨,CAG,谷氨酰氨,CGU,精氨酸,CGC,精氨酸,CGA,精氨酸,CGG,精氨酸,U,C,A,G,A,AUU,异亮氨酸,AUC,异亮氨酸,AUA,异亮氨酸,AUG,甲硫氨酸,ACU,苏氨酸,ACC,苏氨酸,ACA,苏氨酸,ACG,苏氨酸,AAU,天门冬酰氨,AAC,天门冬酰氨,AAA,赖氨酸,AAG,赖氨酸,AGU,丝氨酸,AGC,丝氨酸,AGA,精氨酸,AGG,精氨酸,U,C,A,G,G,GUU,缬氨酸,GUC,缬氨酸,GUA,缬氨酸,GUG,缬氨酸,GCU,丙氨酸,GCC,丙氨酸,GCA,丙氨酸,GCG,丙氨酸,GAU,天门冬氨酸,GAC,天门冬氨酸,GAA,谷氨酸,GAG,谷氨酸,GGU,甘氨酸,GGC,甘氨酸,GGA,甘氨酸,GGG,甘氨酸,U,C,A,G,四、遗传密码,图,6-10,生长期细菌群体的,RNA,、,DNA,和蛋白质含量的变化,五、微生物生长与蛋白质合成,2,、蛋白质合成过程,(1),复制：决定该种蛋白质分子结构的相应一段,DNA,链,(,结构基因,),的自我复制；,(2),转录：蛋白质不能直接由,DNA,合成，而通过,DNA,的副本,RNA,合成。转录是双链,DNA,分开，以其中的一条单链为模板转录出一条,mRNA,。,新转录的,mRNA,链的核苷酸碱基的排列顺序与模板,DNA,链的核苷酸碱基排列顺序互补。同样，也可以,DNA,分子的某些部分核苷酸碱基顺序转录成,tRNA,和,rRNA,。,(3),翻译：翻译是由,tRNA,完成的，,tRNA,链上有与,mRNA,链上对氨基酸顺序编码的核苷酸碱基顺序,(,密码子,),互补的反密码子,tRNA,具有特定识别作用的两端：,一端,识别特定的、在,ATP,和氨基酸合成酶作用下被活化的氨基酸，并与之暂时结合形成氨基酸,tRNA,的结合分子。,另一端,有三个核苷酸碱基顺序组成反密码子。,tRNA,上的反密码子能识别,mRNA,上的与之互补的密码子，并与之暂时结合。,(4),蛋白质合成：通过两端识别作用，把特定氨基酸转送到一定位置上，使不同的氨基酸按照,mRNA,上的碱基顺序连接起来，在多肽合成酶的作用下合成多肽链,(mRNA,的碱基顺序决定了多肽链上氨基酸的排列顺序,),，多肽链合成后组成特定的蛋白质结构。,图,6-11,原核微生物的,DNA,转录为,mRNA,示意图,注：图中启动子即启动密码，终止子即终止密码,图,6-13,真核微生物的,DNA,转录（,mRNA,合成）,原核生物与真核生物,RNA,转录的区别,1.,真核生物,RNA,的转录是在细胞核内，翻译在细胞质中进行；原核生物则在核区同时进行转录和翻译；,2.,真核生物一个,mRNA,只编码一个基因；原核生物一个,mRNA,编码多个基因；,3.,真核生物有,RNA,聚合酶,、,、,等三种不同的酶；原核生物则只有一种,RNA,聚合酶；,4.,真核生物中转录的起始更复杂，,RNA,的合成需要转录因子的协助进行转录；原核生物则较为简单；,5.,真核生物的,mRNA,转录后进行加工，然后运送到细胞质中进行翻译；原核生物无需进行加工，边转录边翻译。,原核生物转录水平的调控,-,乳糖操纵子模型,1.,调节基因和结构基因,.,2,调控位点,(1) Operator,操纵基因,(2),CAP(catabolite,gene activation protein),or,CRP(cAMP,受体蛋白,),结合位点,(3),Promotor,3,别乳糖,为诱导物,4,本底组成型,(background constitutive,synthesis),组成型,(constitutive gene),即,看家基因,（,Houskeeping,gene),未,发现,乳糖,第二节 微生物的变异,一、变异的实质,基因突变,基因突变,：,DNA,因某种因素引起碱基的缺失、置换或插入，改变了基因内部原有的碱基排列顺序，从而引起其后代表型的改变,.,二、突变的类型,（一）自发突变,:,指微生物在自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变,（二）诱发突变,指在细菌的环境中加入理化因素而诱导细菌发生的突变。,凡提高突变率的理化因子都可称诱变剂（,mutagen,）,1,、,物理诱变,:,（,1,） 紫外辐射诱变作用机制：,主要的生物效应是,DNA,吸收紫外辐射，引起,DNA,结构的变化。引起,DNA,结构的变化有很多方面：,DNA,断裂、,DNA,交联、,DNA,与蛋白质交联、胞嘧啶与鸟嘌呤的水合作用及嘧啶二聚体的形成。,（,2,）,DNA,损伤的修复,光复活和暗复活,光复活：光裂合酶在可见光下（,300-500nm,）,会因获得光能而发生解离从而使二聚体重新分解成单体。,暗复活：切除修复和重组修复,切除修复：,需要三种酶协同作用，不需要可见光的激活。首先在二聚体两侧核酸内切酶作用下造成单链断裂并切除二聚体。,DNA,聚合酶,I,作用下修复，最后,DNA,连接酶缝合新合成的,DNA,片段和原,DNA,片段。,重组修复：,必须在,DNA,进行复制的情况下进行，所以又称复制后修复。大肠杆菌可以在不切除胸腺二聚体情况下以带有二聚体的这一单链为模板而合成互补单链，但在二聚体附近留下了一个空隙，经过染色体交换，使空隙部分面对正常单链，,DNA,聚合酶和连接酶将此修复。,SOS,修复：,DNA,大范围损失作为一种求救信号引发设计,DNA,修复的多种细胞功能参加的诱导作用。正常的,SOS,系统被,LexA,蛋白所抑制，,DNA,损伤时激活,RecA,蛋白酶活性，使,LexA,蛋白失活，启动,SOS,系统。一旦修复完成，,SOS,系统关闭。,SOS,系统是一种倾向差错的,DNA,修复机制，可造成突变。,适应性修复：,细菌由于长期接触低剂量诱变剂会产生修复蛋白酶，修复,DNA,上因甲基化而遭受的损伤。,2,、化学诱变,化学诱变可造成碱基对的置换,转换,（,transition,）：,嘌呤被另一嘌呤或嘧啶被另一嘧啶取代。,颠换,（,transversion,）：,嘌呤被嘧啶取代。,化学诱变对,DNA,的作用形式有三类：,（,1,）直接引起置换的诱变剂,是一类可直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂。可与一个或几个核苷酸发生化学反应，引起,DNA,复制时碱基配对的转换。,亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨，使腺嘌呤,A,转变为次黄嘌呤,H,，胞嘧啶,C,变成尿嘧啶,U,，引起,A=T,向,G=C,转换,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（,He,）,He,通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（,HK,）,DNA,复制时，,HK,与胞嘧啶（,C）,配对,DNA,第二次复制时，,C,与,G,正常配对，实现了转换。,（,2,）间接引起置换的诱变剂：这类诱变剂是一些碱基类似物，,5-,溴尿嘧啶（,5-Bu,）、,5-,氨基尿嘧啶（,5-Au,）、,8-,氮鸟嘌呤（,8-NG,）、,2-,氨基嘌呤（,2-AP,）,等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到,DNA,分子后引起的，因此是间接的。,（,3,）引起移码突变的诱变剂：由诱变剂引起,DNA,分子中的一个或少数几个核苷酸的增添、插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。,3,、复合处理及协同效应,两种或多种诱变剂先后使用；,同一种诱变剂重复使用；,两种或多种诱变剂同时使用,4,、定向培育与驯化,:,用某一特定环境长期处理某一微生物群体，不断移种传代，从中选择具有合格性状的自发突变体。因自发突变率低，变异程度低，培育进程很缓慢。,环境工程中仍采用定向培育的方法培育菌种,驯化。,第三节 基因重组,一、定义,两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为,基因重组,(gene recombination),或遗传重组,(genetic recombination),，,简称重组。,可通过杂交、转化等手段达到基因重组。,二、杂交,(,接合,),杂交是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组,(,如酵母菌和霉菌等,),，或者是通过双亲细胞的沟通，使部分染色体基因重组,(,如细菌,),。,在真核微生物和原核微生物中可通过杂交获得有目的的、定向的新品种,。如含有固氮基因的肺炎克氏杆菌,(,Klebsiella,pneumoniae,),的固氮基因传递给大肠杆菌，产生了含有固氮基因并有固氮能力的,nif,+,大肠杆菌，对农业生产和缺氮的工业废水处理很有意义。,三、转化,(transformation),（,引进）,受菌体直接吸收供菌体的,DNA,片断而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。,DNA,片断,新的性状细胞,供体细胞,研碎,微生物转化过程基本过程：,1928,年，,Griffith,发现肺炎链球菌的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。,通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子,(,transformant,),。,四、转导,(transduction),（,间谍窃取）,通过,缺陷噬菌体,(defective phage),的媒介，把供体细胞的小片段,DNA,携到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。,由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子,(,transductant,),。,Transduction,Figure 8.28,Recombinant,1,Phage protein coat,Bacterial chromosome,2,3,Bacterial DNA,Phage DNA,4,Recipient cell,5,Donor bacterial DNA,Recipient bacterial DNA,Recombinant cell,A phage infects the donor bacterial cell.,Phage DNA and proteins are made, and the bacterial chromosome is broken down into pieces.,Occasionally during phage assembly, pieces of bacterial DNA are packaged in a phage,capsid,. Then the donor cell lyses and releases phage particles containing bacterial DNA.,A phage carrying bacterial DNA infects a new host cell, the recipient cell.,Recombinant can occur, producing a recombinant cell with a genotype different from both the donor and recipient cells.,第四节 突变体及重组子的检测与筛选,人们用某种诱变因子诱导微生物产生突变体，目的是为了从中获得优良的目的品种突变体。因此，需要用一定的检测方法检测与筛选。,一、突变体的检测,的方法,（一）直接检测表现型,直接检测表现型是最简便易行的检测方法。,识别特征：,光滑型菌落（正常细菌） 粗糙型菌落（突变株）,通过观察菌落就可识别，直观而又快速。,正常细菌,原产,红色素、,呈,红色,的,菌落,突变株,无色菌落,诱变 、培养,图,6-20,影印平板技术（正常菌,E.coli,）,注：图中红色实心者为正常菌落；蓝色实心者为突变株,（二）间接检测法,有许多的突变体不能用直接检测获得，如高温菌、低温菌、嗜酸菌、嗜碱菌及营养缺陷型的微生物要通过控制培养条件而获得。,对于转入质粒等的重组子，可以采用抗性进行筛选。,第五节 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,一、遗传工程技术在环境保护中的应用,（一）质粒育种,质粒是细菌体内一种独立于染色体外，与细菌细胞共生能独立复制和稳定地延续遗传的遗传单位，其基因由环状双链共价闭合,DNA,分子组成，长,1-200kb,。,不带有重要基因，存在与否不对细菌产生致死效应。,不同质粒拷贝数不同，根据其数目分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒多半是一些具有自身传递性能力的大质粒，其,DNA,复制与宿主染色体,DNA,复制相偶联，每个细胞仅,1-2,个拷贝，不能充当载体。松弛型质粒约为,10-200,个，,DNA,复制不与染色体,DNA,偶联复制调控以松弛的方式进行。,根据质粒的功能可分为抗药性质粒、降解质粒、载体质粒等。,目前已知的降解质粒有,4,类：,石油降解质粒,农药降解质粒,工业污染物降解质粒,抗重金属离子的质粒,多质粒超级细菌,图,图,6-21,用遗传工程获得多质粒超级细菌,二、基因工程技术在环境保护中的作用,基因工程是指在基因水平上的遗传工程，又叫基因剪接或,DNA,体外重组。,基因工程育种打破了物种界限，突破了亲缘关系的限制，加快突变速度，并且可以定向突变创造出自然界所没有的生物，其应用标志着现代遗传学已发展到能定向获得遗传性状的新阶段。,1,、目的基因的获得,2,、,DNA,体外重组,3,、将重组体转入受体细胞,4,、重组体克隆的筛选和鉴定,5,、外源基因表达产物的分离与提纯,PCR,的原理和操作：,1,、加热变性：将待扩增的,DNA,置于,94-95,度高温水浴中加热,2,、,退火：将加热变性的单链,DNA,溶液的温度缓慢下降至,55,度，引物,DNA,碱基与单链模板,DNA,配对,3,、延伸：冷至延伸温度时，加入,Taq,DNA,聚合酶反应,1min,变性复性延伸，反复,25-30,次。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察。,三、,PCR,技术在环境保护中的应用,PCR,在环境微生物学的应用主要集中在：,1,、研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态,2,、监测环境中特定的微生物如致病菌和工程菌,DGGE-,微生物多样性,变性梯度凝胶电泳（,DGGE,）,:,一种分离相似大小,DNA,片段的电泳方法。即双链,DNA,在变性剂,(,如尿素或甲酰胺,),浓度或温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于,Tm,值不同，,DNA,的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。,环境样品基因组,DNA,的提取,目标片段的,PCR,扩增,DGGE,图谱的分析,图像的采集和条带的回收,DGGE,分析,电泳前准备工作,电泳分析,剥胶、染色,DGGE,条带测序,DGGE,分析微生物群落的主要步骤,细节决定成败！,DGGE,分析,DGGE,图谱的聚类分析、相似性分析,DGGE,图谱的分析,DGGE,图谱的主成分分析,第六章,-,回顾,什么是微生物的遗传性和变异性？遗传和变异的物质基础是什么？如何得以证明？,微生物的遗传基因是什么？微生物的遗传信息是如何传递的？,DNA,是如何复制的？何谓,DNA,的变性和复性？,微生物生长过程中蛋白质是如何合成的？细胞是如何分裂的？,微生物变异的实质是什么？微生物突变类型有几种？变异表现在哪些方面？,DNA,损伤修复有几种形式？各自如何修复？,何谓基因工程？它的操作有几个步骤？,什么叫,PCR,技术？有几个操作步骤？,