第三章抗生素发酵生产工艺

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,1,第十一章,抗生素发酵生产工艺,主讲教师：生科院洪军,2,制药微生物生产菌种如何选育？发酵过程中主要检测的参数有哪些？,发酵工艺过程如何控制？,知识回顾,3,主要内容,抗生素的概述：,（1）抗生素的定义,（2）抗生素的命名,（3）抗生素的分类,青霉素的发酵生产工艺：（重点）,（1）,青霉素的概述,（2）,生产菌的生物学特性,（3）,发酵工艺过程,4,1,抗生素的定义和命名,（,1,）,抗生素的定义,早期：,一般认为来源于微生物，且主要作用于细菌感染。故认为,抗生素,(antibiotics),是微生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做,抗菌素,。,5,现在：,来源：,随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生素的来源正在扩大。可以是,微生物、植物,（如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等） 、,动物,（如鱼素、红血球素等） 。但抗生素的工业化生产主要是来自,微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。,作用对象：,病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。,6,定义：,虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。,目前，一个,大多数专家所接受的定义,是：,抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其生命活动过程中产生的或,（化学合成获得的）,，能在,低浓度下,有选择地抑制他种生物机能的,低分子量的有机物质,。,狭义的定义,是：抗生素是,低分子量,的微生物代谢产物，能在很,低的浓度,下抑制其他微生物的生长。,7,按生物的来源：,凡是在动、植物或微生物产生的，可按来源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素,按化学结构命名：,化学结构性质清楚的，如四环素（含有四并苯的基本母核），氯四环素（金霉素），氧四环素（土霉素）。,名称,R1,R2,微生物来源,四环素,H,H,金色链霉菌,金霉素,H,OH,金色链霉菌,土霉素,Cl,H,龟裂链霉菌,其它：,纪念意义、产地、俗名如正定霉素、井冈霉素、金霉素和土霉素等。,（,2,）抗生素的命名（,一般分为三类）,8,H,N,O,N,S,CH,3,CH,3,H,COO-,H,-lactam ring,-,内酰胺 环,R,natural penicillin,R =,CH,2,-CO-,9,-,内酰胺 环,苯甲异噁唑青霉素,氨 苄青霉素,羧苄青霉素,苯氧甲基青霉素,10,2,抗生素的发展简史,2.1,治疗和发展,我国的发展,：,1953,年,5,月,1,日，建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂（上海第三制药厂）；,1958,年,6,月,3,日，最大的抗生素联合企业建成投产（华北制药厂,石家庄）,，也是青霉素发酵总容积居世界首位。,目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。,11,抗生素滥用的重灾区,中国,是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国：年产抗生素原料大约,21,万吨，出口,3,万吨，其余自用（包括医疗与农业使用,),，人均年消费量,138,克左右,(,美国仅,13,克,),。,2011,年,4,月,7,日是世界卫生日，首届合理用药大会在这一天召开，恰好契合了世界卫生日的主题,“,抵御耐药性：今天不采取行动，明天就无药可用,”,。,12,“,后抗生素时代”,如果不再控制抗生素的滥用状态，二十一世纪人类有可能失去抗生素这个有利的治疗武器，重新回到没有抗生素的时代，所谓,“,后抗生素时代,”,。,后抗生素时代是倒退，我们可能回到没有药物可使用的状态，大量的传染性疾病将危害人类的身体健康和生命。虽然这是一种悲观的想法，但悲观的很有道理，,细菌产生耐药速度比新药物开发的速度快得多,，这是一个确实的现象。,13,3,抗生素的分类,可根据,生物来源,、,作用对象,、,化学结构,、,作用机制,、,生物合成途径,等方面对抗生素进行分类。,3.1,根据抗生素的生物来源分类,(,生物学家,),（,1,）放线菌产生的抗生素：,如链霉素、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素）,、放线菌素类（如放线菌素,D,）等。（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之）,（,2,）真菌产生的抗生素：,如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。,14,（,3,）细菌产生的抗生素：,如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如多粘菌素。,（,4,）植物或动物产生的抗生素：,从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。,3.2,根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家）,（,1,）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制,G,+,，又抑制,G,-,（,2,）抗,G,+,的抗生素：如青霉素，,（,3,）抗,G,-,的抗生素：如链霉素,（,3,）抗真菌的抗生素：如制霉菌素,（,4,）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。,（,5,）抗癌的抗生素：如阿霉素,15,3.3,根据抗生素的化学结构分类（化学家）,较复杂，目前已确定结构的抗生素习惯如下分类：,（,1,）,-,内酰胺类,抗生素：包括青霉素类，头孢菌素类等,（,2,）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等,（,3,）大环内脂类,抗生素：如红霉素、麦迪加霉素,（,4,）四环类,抗生素：如四环素、土霉素,（,5,）多肽类,抗生素：如多粘菌素、杆菌肽,（,6,）蒽环类,抗生素：如阿霉素、柔红霉素,（,7,）喹诺酮类,抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星,16,3.4 根据作用机制分类,此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。,（1）,抑制细胞壁合成,的抗生素：如青霉素。,（2）影响,细胞膜功能,的抗生素：多烯类抗生素。,（3）抑制病原菌,蛋白质合成,的抗生素：四环素。,（4）,抑制核酸合成,的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。,（5）,抑制,生物能,作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素。,17,18,3.5,根据抗生素的合成途径分类,（,1,）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。,（,2,）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。,（,3,）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等丙酸衍生物。,19,生产方法：,1,、生物合成法：,传统方法,“,工程菌,”,制造法,细胞融合技术法,2,、化学合成法；,3,、生物合成加化学合成法。,4,抗生素的生产工艺,20,1,、生物合成法：,传统方法,大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。,传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,21,“,工程菌,”,制造法,第一次由“工程菌”制造的全新抗生素,麦迪紫红素,A,，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。,我国新构建的生产,丁胺卡那霉素,的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。,22,细胞融合技术法,对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高,140,倍。,目前,DNA,重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等,20,多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世,。,23,2,、化学合成法,根据某种,抗生素的化学组成和结构，通过,化学合成的方法，可生产部分,抗生素。,如：氯霉素、磷霉素等。,经过,化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的,抗生素可用,化学合成法生产。,24,3,、生物合成加化学合成法,许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。,为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。,现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,25,抗生素制备的一般流程图,菌种,孢子制备,种子制备,发酵,发酵液预处理及种子加滤,提取及精制,成品检验,前体,发酵阶段,提取阶段,成品包装,5,青霉素概述,26,27,青霉素的理化性质,青霉素本身为一元酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。,易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有机溶剂。,游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌效力。,不耐热，一般保存于冰箱中，但青霉素盐的结晶纯品，在干燥条件下可于室温保存数年。,青霉素的抗菌效力与其分子中的,-内酰胺环有关。,28,抗菌作用和临床应用,青霉素主要抑制G,+,菌，但对某些G,-,菌，螺旋体及放线菌也有强大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。,青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。,29,菌种,：产黄青霉,生长发育分,七,个阶段：,期：菌丝生长期，适宜做种子；,期：,青霉素分泌期,；,期：菌丝体自溶期。,5.1,青霉素,生产菌的特性,点青,霉,30,青霉素产生菌的生长过程,分生孢子发芽期,菌丝繁殖期,脂肪粒形成期,脂肪粒减少，小空孢,大空孢,自溶,菌丝生长期,青霉素分泌期,菌丝自溶期,第,1,期：分生孢子萌发，具有小泡。,第,2,期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。,第,3,期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。,第,4,期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。,第,5,期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体,消失，青霉素产量最高。,第,6,期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，,pH,上升。,第,7,期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化,镜检控制,规定时间取样，显微镜观察,7,个时期的,态变化，控制发酵。,1,4,期为菌丝生长期，,3,期的菌体适宜,种子。,4,5,期为生产期，生产能力最强，通,过,工程措施，延长此期，获得高产。,第,6,期到来之前结束发酵。,带放补料,工,6.1,青霉素生产流程,结晶器,种子罐,1,和,2,米孢子,预处理罐,过滤器,发酵罐,萃取器,蒸发器,工业盐,提,炼,工,艺,艺,发,冷冻干燥孢子 琼脂斜面,酵,培养基制备,无菌空气,冷至,15,6.,青霉素发酵工艺过程,(1),、生产孢子制备,斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固,体培养基进行培养，最适温度,25-26 ,，培养,6-8,天，形,成单菌落。再传斜面，培养,7,天，形成绿色斜面孢子。,米孢子：移植到小米或大米固体培养基,上，生长,7,天，,25,注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试,验，测定效价及杂菌情况。,6.2,青霉素发酵工艺过程,(2),、种子罐培养工艺,一级种子发酵：,发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。,培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫,剂等。,空气流量,1,：,3,（体积比）；充分搅拌,300-350rpm,；,pH,自然，温度,27,1, 40h,二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量,10,培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。,通气量,1:1-1.5,；搅拌,250-280rpm,；,pH,自然，,25,1,。,10-14h,质量：菌丝致密，菌丝粗壮，,III,期，倍增期,6-8h,(3),、生产罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量,20,培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，,硫代硫酸钠，苯乙酰胺，,CaCO,3,玉米油,硅油,.,参数条件：,通气量,1,：,0.8-1.2,；,150-200r/min,；,前,60,小时,:pH6.4-6.6,，,26,；,60,小时后,: pH6.7, 24,。,6.3,发酵培养与过程控制,操作方式：反复分批式发酵,发酵罐：,100m,3,，装料,80m,3,.,带放,: 6-10,次，带放量,10,，间隔,24h,。,发酵周期：,180-220,h,发酵过程需连续流加葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。,过程控制,补料分批操作控制基质浓度,前,40,小时：培养基中的主要营养物,40,小时后：低速连续补加葡萄糖、,氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。,半饥饿状态：延长合成期，提高产量。,碳源占成本,12,以上，采用糖化液流加,降低成本。,糖与,6APA,结合形成糖基,-6APA,，影响青霉素产量。,a.,流加碳源控制,根据残糖、,pH,、尾气中,CO,2,和,O,2,含量。,残糖,0.3-0.6,左右，,pH,开始升高时流加糖。,葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成,速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至,引起自溶。,(1),培养基,b.,流加氮源控制,玉米浆,:,最好，含有多种氨基酸,及其前体苯乙酸和衍生物。,补加无机氮源：,硫酸铵、氨水、尿素,氨基氮浓度：,0.01-0.05%,。,c.,盐离子控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。,铁对青霉素合成有毒，,30-40 ug/ml,以下。,罐壁涂环氧树脂保护层。,d.,添加青霉素侧链前体,时期：合成阶段,种类：,苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、,苯乙酰甘氨酸,毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。,策略：低浓度流加,浓度：,苯乙酸,0.1%,，苯乙酰胺,0.05-0.08%,控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,(2).,温度控制,适宜菌丝生长温度,30,，分泌青霉素,25,。,20,青霉素破坏少，周期很长。,变温控制，不同,阶段不同温度。,生长阶段,:,较高温度，缩短生长时间；生产阶,段适当降低温度，以利于青霉素合成。,前期控制,26,左右，后期降温控制,24,(3). pH,控制,合成适宜,pH6.4,6.6,左右，避免超过,7.0,直接加酸或碱：自动控制,流加葡,萄糖：恒速；变速，依赖,pH,变化快慢。,pH,下降：补加,CaCO,3,、通氨、尿素或提高通气量,pH,上升：补加糖、生理酸性物质（,硫酸铵、油脂）,(4).,溶氧控制,30,饱和度，产率急剧下降；,10,，造成不可逆的损害。,临界溶,氧浓度：,30,。,通气比：,1,：,0.8,1.5,。,适宜的搅拌速度,:,保证气液混合，提高溶,氧,调整搅拌转速,:,各阶段的生长和耗氧量不同。,(5).,消沫,天然油脂：玉米油；,化学消沫剂：泡敌。,策略：少量多次。,注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢,。,7,青霉素的提炼工艺过程,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活,水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定,易溶于有机溶剂，水中溶解度很小,青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性,防止降解，条件温和、快速。,(1),、预处理,青霉素的存在部位：发酵液,浓度较低：,10,30Kg/m,3,含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁,多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等,目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液,的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。,预处理,:,发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白,(2),、过滤,鼓式真空过滤机过滤：,一次滤液：,pH6.2-7.2,，略浑，棕黄或绿色，蛋,白质含量,0. 5-2.0%,。,板框式过滤机过滤：,硫酸,调节,pH4.5-5.0,，加入,0.07%,溴代十五烷吡,啶，,0.07%,硅藻土为助虑剂。,二次滤液：澄清透明，用于提取（收率,90,）,(3),、溶剂萃取,原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而,霉素盐易溶于水。,萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。,工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。,除去蛋白质：加,0.05-0.1%,乳化剂,PPB,。,萃取：,2,3,次。,逆流萃取过程,正相萃取：酸化,pH1.8-2.0,，滤液：醋酸丁,酯,1,：,0,.3,，碟片式离心机分离（浓缩,1.5-2,.1,）,反 相 萃 取 ：,pH6.8-7.4,（ 磷 酸 盐 、 碳,酸 盐 缓 冲,液）。,把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。,反复萃取,2,3,次，达到结晶,要求。,萃取条件：,10,下。萃取,罐冷冻盐水冷却。,(4),、脱色,萃取液中添加活性炭，除去色素,过滤，除去活性炭。,(5),、结晶,直接结晶,加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。,加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,(5),、结晶,共沸蒸馏,结晶,萃取液，再用,0.5 M NaOH,萃取,pH6.4-6.8,下得到钠盐水浓缩液。,加,3-4,倍 体 积 丁 醇 ，,16-26,， 真 空,0.67-1.3KPa,）下蒸馏。,水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。,结 晶 经 过 洗 涤 、 干 燥 （,60,真空,16h,）,， 磨粉，装桶，得到青霉素产品。,思考题,（,1,）青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？,（,2,）如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？,（,3,）青霉素发酵过程的控制原理及其关键点是什么？,（,4,）青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？,