生物技术

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/10/30,#,单击此处编辑母版标题样式,基因工程,生物技术,20,世纪,70,年代初,利用重组,DNA,实验将哺乳动物基因导入细菌体内,并表达成功,开创了生物技术制药工业,.,短短,20,余年时间就获得了诸如人胰岛素、人生长素、,-,干扰素、白细胞介素,-2,等多种生物技术药品,并已上市,.1997,年美国已批准上市的基因工程药物、疫苗和注射用单克隆抗体达,39,种,2004,年已超过,150,种,.,一,、,基因工程的历史背景,自,20,世纪,70,年代基因工程诞生以来,最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学,基因工程技术的迅猛发展是人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质,甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质,.,概念,也叫 基因操作,遗传工程,重组,DNA,技术,二、,基因工程概述,用人工方法，把生物的遗传物质分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表 达的技术。,三,、,基因工程主要原理,克隆目的基因，取得所需要的,DNA,特异片段。,与,DNA,载体连接成重组,DNA,。,引入细菌或动植物细胞并使其增殖。,挑选出受体细胞，指导合成蛋白质或优良新品种。,基因工程四个步骤,（一）核酸分子的提取技术,（二）电泳技术,（三）各种酶的使用,（四）基因克隆,（五）体外重组,（六）载体构建,（七）转化,（八）重组体的筛选与鉴定,（九）培育新型品种,四、基因工程操作技术及原理,分类：,RNA,的提取,总,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,方法：首先，粉碎组织细胞；,其次，,DNA,用乙醇等进行沉淀；,最后，用苯酚、氯仿等洗涤 纯化。,（一）核酸分子的提取技术,概念：,带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。各种生物大分子在一定,pH,值条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。,分类：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉冲电场凝胶电泳。,（二）电泳技术,1,、限制性内切酶的使用,概念：是一类能识别双链,DNA,中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有,3-OH,基团和,5-P,基团的,DNA,片段的内切脱氧核糖核酸酶。,分类：,型酶、,型酶和,型酶。,（三）各种酶的使用,2,、,DNA,连接酶的使用,DNA,连接酶能够催化具有,3-OH,基团和,5-P,基团的,DNA,片段之间形成磷酸二酯键。在基因克隆中用来连接载体与目的基因。,3,、,DNA,聚合酶的使用,DNA,聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的,3-OH,端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的,DNA,聚合酶的分离极大促进了基因等,DNA,片段的体外合成与扩增技术的发展。,4,、逆转录酶的使用,逆转录酶可以,RNA,为模板合成,DNA,，即,cDNA,（互补,DNA,）。在基因克隆中常用来构建,cDNA,文库。,1,、克隆已知基因序列的基因,一般用,PCR,扩增方法，根据已知基因的序列设计引物来克隆基因。,在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建,cDNA,文库或基因组文库，然后以该基因（或部分序列）为探针来筛选目的基因的克隆。,（四）基因克隆,2,、功能克隆,根据基因的产物蛋白质克隆基因。首先根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的,mRNA,序列，根据,mRNA,序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。利用抗体或核苷酸探针筛选文库，也可进行,PCR,扩增。,3,、作图克隆,作图克隆技术是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。克隆植物分子连锁图谱定位的基因，可采用作图克隆的策略。作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆（,BAC,或,YAC,库）的染色体步移到达靶基因。,4,、 表型差异克隆,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因。,（,1,）消减杂交法,（,2,）,DNA,标签法,（,3,）差别显示技术包括：,mRNA,差别显示法等。,（,4,）缺陷互补和反义,mRNA,技术,（,5,）,cDNA,微阵列和基因芯片技术,5,、染色体大片段基因克隆,利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。,是将带有目的基因的外源,DNA,片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组,DNA,分子。,（五）体外重组,理想的运载体是质粒，当给它安装一段外来,DNA,片段后，它依然如故地进行自我复制。,（六）载体构建,1,、植物转基因技术,（,1,）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵培养。,（七）转化,（,2,）基因枪法,又称微弹轰击法。其基本原理是将外源,DNA,包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源,DNA,进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化，,（3）,花粉管通道法,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源,DNA,导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因,80,年代初期周光宇转基因抗虫棉不依赖组织培养的新个体。,（,4,）微注射法,首先制备植物原生质体，游离出细胞，在倒置显微镜和显微操作器的帮助下，将目的基因,DNA,通过微管注射到受体细胞中。,（,5,）电穿,在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的直径为,3,4 nm,的小孔，但对原生质体生活力影响不大。这时，存在于原生质体周围溶液中的外源,DNA,，就可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。,孔法,（,6,）微束激光打孔,原生质体在短时间的微束激光照射下，可在质膜表面形成面积约,0.25 m,2,左右的小孔，使,DNA,分子进入细胞。,法,2,、转基因动物技术,世界上主要有,4,类已报道的方法：,1,）融合法，包括精子融介法，微细胞介导融合等。,2,）化学法，包括,DNA-,磷酸钙沉淀法、,DEAE-,葡聚糖法、染色体介导法。,3,）物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等。,4,）病毒感染法，包括重组,DNA,病毒感染、重组,RNA,病毒感染等。,真正成熟方法,显微注射,DNA,法,精子介导法,核移植法,（,1,）核显微注射法,核显微注射法是转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内， 注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育， 这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的,DNA,片段。,缺点：,效率低,表达结果的不确定性,动物利用率低等,在反刍动物：繁殖周期长，较强的时间限制、需要大量的受体动物。,（,2,）精子介导的基因转移,精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给母畜授精。,优点：成本很低，只有显微注射法成本的,1,10,。,由于它不涉及对动物进行手术处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行试验。,（,3,）核移植转基因法,先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞,去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物,。,（八）重组体的筛选与鉴定,技术方法,:,遗传检测法,物理检测法,菌落或噬菌斑杂交筛选法,免疫化学检测法,DNA,蛋白质筛选法,转译筛选法等,（九）培育新型品种,草甘磷是一种广谱除草剂，将含有抗草甘磷的,EP2SP,合成酶突变基因引入植物，就可使植物获得抗除草剂特性，使大田作物便于除草，农业操作简便。,在食品工业方面可提高微生物菌种性能，通过基因工程改造的面包酵母中麦芽糖透性酶和麦芽糖酶的含量比普通面包酵母高，产生二氧化碳气体的量也较高，可制作出更松软可口的面包。,在生产领域,人们可以利用基因技术,生产转基因食品,在环境保护上,基因工程做成的,DNA,探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。,在医疗方面,基因治疗即是基因工程的一种技术方法。此外运用,“DNA,探针,”,检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速，在医疗上也应用广泛，,在基因工程药物的研究方面,将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,五,、基因工程的应用,优点,基因工程技术几乎涉及到人类的生存所必需的各个行业,.,比如将一个具有杀虫效果的基因转移到棉花、水稻等农作物种中,这些转基因作物就有了抗虫能力,因此基因工程被应用到农业领域；要是把抗虫基因转移到杨树、松树等树木中,基因工程就被应用到林业领域；要是把生物激素基因转移到支物中去,这就与渔业和畜牧业有关了；如果利用微生物或动物细胞来生产多肽药物,那么基因工程就可以应用到医学领域,.,总之一句话,基因工程应用范围将是十分广泛的,.,六,、基因工程的优点和缺点,缺点,目的基因有可能会产生有害的基因突变，目的基因一般用脂质体做载体，基因导入效率低，且无靶向性，用腺病毒做载体，导入效率高但会引起严重的免疫反应，还可能会引起目标细胞以外的细胞感染病毒，甚至可能将病毒传染给其他个体或传播到环境中，危害人类的健康,