聚丙烯酰胺凝胶电泳牛血清蛋白

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,聚丙烯酰胺凝胶电泳牛血清蛋白,二、实验仪器,电泳仪,电泳槽,注射器,长针头,吸管,培养皿,三、实验试剂,三羟甲基氨基甲烷（简称,Tris,）,贮备液的配制：按下表配制,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,各贮备液，然后冷藏于,4,条件下，以防变质。,染色液：,0.05%,氨基黑,10B,溶于,7%,醋酸溶液，或者用灵敏度高,5,倍考马斯亮蓝,R250,溶液染色。,脱色液：,7%,醋酸溶液。,电极缓冲液（,甘氨酸,-,Tris,缓冲液）：甘氨酸,，,加水定容至,1000ml.,示踪剂：,0.01%,溴酚蓝溶液。,序号,A,B,C,D,E,F,1mol/L盐酸,Tris,TEMED,ACr,Bis,(NH4)2S2O3,蔗糖,加水并稀释至,PH,48ml,36.6g,0.23ml,100ml,8.9,48ml,5.98g,0.46ml,100ml,6.7,28g,0.735g,100ml,10g,2.5g,100ml,40g,100ml,0.14g,100ml,四、实验步骤,1.制胶：取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。,1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）：,将试剂按A:C:H,2,O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中2535,下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。,2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7 ，浓缩胶）：,将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。,加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。,然后胶管于,烘箱中,2535 ,下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。,把玻璃管下端的橡皮冒除去（拔时用力不要过猛，以防使胶条受损），将胶管安装在电泳仪上。,注意垂直，并要紧密，防止缓冲液从上槽漏下。,先向各胶管中加满电极缓冲液，不要有气泡留存，在向下槽注入缓冲液，然后将胶管下降至下槽缓冲液内。,0.5ml新鲜血清，用5ml20%蔗糖溴酚蓝溶液稀释（有老师配制） 。用微量注射器或移液枪向胶管内加20ul样品液，注意微量注射器或移液枪头要插入胶管内加液。,4.,电泳,上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电，先每管电流3mA电泳，当示踪剂进入分离胶时，电流增至每管5mA。,当示踪剂移至胶管下端1cm处时，关闭电源，取出胶管。电泳大约2-3小时。,取一只带长针头的注射器，灌满水，将针头从浓缩胶的一端小心的管壁与凝胶之间，转动胶管，并同时推动注射器，在针头向前推动时，注入蒸馏水，使胶条随水的压力及润滑作用从玻璃管中脱离。,A.将取下的胶条放入12.5%三氯醋酸中固定10min，用1%考马斯亮蓝水溶液染色15min，7%醋酸过夜保存。,B.将取下的胶条放入7%三氯醋酸中固定10min，用氨基黑10B染色15min，7%醋酸浸泡过夜。,注:染液回收,将脱色胶条取出放于滤纸上，观察分离色带，将结果绘于实验报告纸上。,注意事项,所有,玻璃管和绿套头,，在剥胶完毕后回收回讲台盒子中。,所有,乳胶帽,，在胶凝固后都回收回讲台的盒子中,所有,针管,和,针头,剥胶完成后回收回讲台,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,