2016现代组织化学技术组织化学

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/11/21,#,现代组织化学技术,华中,科技大学同济医学院,解剖学,系组织胚胎学,教研室,李宏莲,组织化学,与细胞化学,1.,什么是组织化学,与细胞化学,技术？,-,介于细胞生物学、组织学、化学、生物化学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学,-对组织与细胞的化学成分或者酶活性进展定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化学,-在保持组织或细胞根本不改变其生活状态时的微细构造的条件下，利用某些特异性的反响，采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律,Histochemistry and cytochemistry,一、绪论,2.,组织化学,与细胞化学,技术的特点,H,E,染色,H,E,染色,普通组织学技术：,组织原位，染色，显微镜观察,一、绪论,组织原位，特异性的化学反响，显微镜观察,对组织或者细胞内特定物质进展定性，定位， 定量分析,组织化学与细胞化学技术,铅法（,ATP,酶）,2.,组织化学,与细胞化学,技术的特点,一、绪论,PAS,法显示粘多糖,3.,组织化学,与细胞化学技术的主要类型,(1),一般组织化学与细胞化学,(2),免疫组织化学与细胞化学,(3),原位杂交组织化学,*,每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分,一、绪论,化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方法，免疫学方法，分子生物学方法等,常用,分类,：,4. 组织化学与细胞化学技术的根本要求,一、绪论,保持组织和细胞的完整性,被检物质具有不溶性和或可视性,反响具有特异性,反响具有灵敏性,可重复性,1. 取材draw material,(1) 组织标本取材：,准备充分、麻醉或处死方法适宜、操作迅速、刀应锐利、适当清洗、离体即固定或冷冻切片，或保存于-80冰箱、大小适中约2.5cm2.5cm0.2cm，宁可面积大，不能厚,(2) 细胞标本取材：,涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低时可先沉淀或者离心；,爬片法：贴壁生长的培养细胞；,印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞,二、标本的制备,2. 固定fixation,(1) 固定的目的：,保持组织细胞原有的形态构造；使组织硬化；对组织化学及细胞化学技术来说-保存酶活性和蛋白质的抗原性非常重要,(2) 固定的优、缺点：,优点：使组织细胞的形态构造得到保持,缺点：拟检物质反响性减弱，酶的活性易受损,二、标本的制备,二、标本的制备,2.,固定,(3) 常用固定剂的种类及特点,单一固定剂：,交联固定剂,甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织形态构造保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能局部或完全遮盖抗原决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间824小时，降低固定温度4、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗原反响性。常用的有：10%福尔马林即4%甲醛、4%多聚甲醛应用最为广泛、2.5%戊二醛等,戊二醛含两个醛基，对膜构造固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响,二、标本的制备,2.,固定,(3) 常用固定剂的种类及特点,单一固定剂：,凝固沉淀固定剂,丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜构造会破坏，因此对细胞构造保存不好。固定方法在4，3060 min 为宜。,其他固定剂,铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等,四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反响形成交联，保存微细构造作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂,二、标本的制备,2.,固定,(3) 常用固定剂的种类及特点,混合固定剂：,Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等,Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响,Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用,Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微构造的保存优于Bouin固定液,2. 固定,(4) 固定的方法,浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸渍法和灌注法用的最多,浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好标记，直接将组织块修整为适宜大小，投入到样品体积的40倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情况而定,二、标本的制备,2.,固定,(4),固定的,方法：,灌流法,：,适用于动物实验中对缺氧敏感的器官，如神经系统、胃肠等取材。,二、标本的制备,包括推注，滴注,滴注步骤(大鼠)：,开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液，剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕，将动物装入含少量固定液的塑料袋置4C冰箱内静置2h后取材或立即取材，放入固定液中进展后固定,大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血,固定液的输入量因个体不同而异，5002,000毫升不等,冲洗液,固定液,动物,2. 固定,(5) 影响固定的因素：,组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透,固定液的量要适宜：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，可在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，保证组织块各个方向都有利于固定剂的渗入,选择适宜的固定剂：根据不同的组织以及后续研究方法的特点选择适宜的固定剂，渗透性强，又不使组织过度收缩或者膨胀,固定时间的长短：根据固定剂的种类、组织块的大小和性质、气温等不同而确定，固定时间太短，不能保持组织块的微细构造，固定时间过长，会降低组织内物质的反响活性，如酶的活性，对抗原的保存也不利,(5) 固定后的洗涤：根据不同情况充分洗涤,二、标本的制备,3. 包埋embedding,(1) 包埋的目的：,将某种特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物即包埋剂的理化特性如由固态变液态，液态变固态等，将整个组织加以包裹，最后凝固成均匀一致的固态构造，用切片机切成极薄的切片,(2) 包埋剂的种类：,非水溶性：石蜡、树脂、火棉胶等，包埋前必须脱水和透明,水溶性：明胶、OCT聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物等，包埋前不需要脱水和透明,二、标本的制备,3. 包埋,(3) 石蜡包埋：,石蜡与水不相溶，包埋前必须脱水和透明，然后用熔化的液态石蜡对组织进展浸透，将浸透好的组织和石蜡放在室温条件下让其凝固，方便切成极薄的切片,脱水dehydration：,用脱水剂置换组织中的水分，脱水会使组织收缩、变脆，因此脱水剂的浓度由低到高，采用适宜的脱水剂和脱水时间与组织块大小和构造性质相关，最常用的为乙醇，组织比较致密可用正丁醇,二、标本的制备,* 柔软的组织可从更低的浓度开场，脱水的容器密闭性要好，防止吸收空气中的水分,3. 包埋,(3) 石蜡包埋：,透明clearing：,脱水剂一般跟石蜡不互溶，用透明剂置换脱水剂，并使组织呈现透明状态，便于浸蜡和包埋,常用透明剂为二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等,二甲苯透明能力强，易使组织收缩变脆，因此时间不能太长。可以经常观察透明进展。如果脱水不彻底，会出现“枣核样的非透明区，必须返回到脱水剂中重新彻底脱水,二、标本的制备,3. 包埋,(3) 石蜡包埋：,浸蜡paraffin infiltration：,使熔化的石蜡液浸入到已经透明的组织中，彻底置换掉透明剂。浸蜡选择熔点为5860C的石蜡，制备免疫组织化学标本应该选用更低熔点的石蜡，更换12次，每次0.51小时,* 浸蜡和包埋所用的石蜡必须经过熔化后用滤纸过滤除去杂质,* 将组织块从透明剂中移入到液态的石蜡中时，动作要迅速，否那么液态的石蜡很容易凝固，影响到浸蜡的效果,二、标本的制备,3. 包埋,(3) 石蜡包埋：,包埋embedding：,将已浸蜡的组织块置入装有新熔化石蜡的包埋模具内，移出烤箱，即会迅速冷却凝固，包埋时注意将标本的切面向下，即标本的切面接触包埋模具的底面,* 将组织块从浸蜡中移入到包埋模具中，动作要非常迅速，否那么石蜡很容易凝固，影响包埋效果,* 包埋的温度不能过高或者过低，普通组织学染色可以在65C，免疫组织化学染色不能高于60C,二、标本的制备,3. 包埋,(3) 石蜡包埋：,修块：,石蜡凝固后，组织便包封在石蜡内。切片前需把包有组织的蜡块修成一定形状，并且把各个面修平，注意不能使蜡边与组织边靠得太近亦不能太远，近那么不易连片，远那么废切片刀。在修块时选适当的地方做标记，便于日后识别,二、标本的制备,3. 包埋,(4) 火棉胶包埋：,常用于较大组织和器官的包埋，如大小脑，以及容易塌陷的器官，如眼球和胚胎器官等，对组织的收缩作用小，保持原有构造的效果好，但火棉胶包埋所需时间长，包埋的组织块不能做薄切片和连续切片,火棉胶溶液配制：,称取枯燥的固态火棉胶，溶解于100ml的乙醚-无水乙醇比例是1:1配制成2%、4%、8%、16%的火棉胶液备用。火棉胶不易溶解，将其置入棕色瓶子内，经常摇动,* 固体状态的火棉胶和配制成液体的火棉胶，均是易燃品，因此使用过程中要避开明火,*火棉胶容易吸收水分而成乳白状，在贮存和使用过程中要注意防水,二、标本的制备,3. 包埋,(4) 火棉胶包埋：,包埋：,梯度酒精脱水，乙醚-无水乙醇浸泡24 h，不需透明在不同浓度的火棉胶中分别浸泡24 h到1周，取出后放入含足量16%火棉胶的包埋盒中,硬化：,继而放入枯燥箱内放置24 h，开启盒盖，使乙醇和乙醚挥发，包埋块逐渐硬化呈胶样，去掉包埋盒，包埋好的组织块放入70%乙醇或氯仿中24 h，最后放入1:1的95%乙醇-甘油中保存备用,二、标本的制备,3. 包埋,(5) 树脂包埋：,以树脂作为包埋剂，包埋质地坚硬，易于制作很薄的切片。电镜水平的标本包埋常用环氧树脂，其包埋方法见电子显微镜技术中“超薄切片技术，光镜水平的标本包埋常用水性树脂-甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯,包埋剂配制：分别配制浸透剂和催化剂,标本固定和脱水：醛类固定剂常用，梯度酒精脱水，但是脱水可不彻底,包埋：先入浸透剂，后入浸透剂和催化剂混合液中进展聚合包埋,二、标本的制备,4. 切片section,必须切成薄片才能染色,重点介绍石蜡切片、冰冻切片和振动切片,石蜡切片：,优点：切片较薄，48m，组织构造保存好，抗原定位准确，连续切片,缺点：脱水透明及高温包埋，处理时间长，抗原活性容易受损，脂类物质等易被溶解,过程：固定蜡块-调整切面-修块-调整切片厚度-切片-展片-贴片-烤片,二、标本的制备,4. 切片section,(2) 冰冻切片恒冷箱切片机：,优点：不用脱水透明高温包埋，处理时间大为缩短，抗原保存较好，可用于未固定的标本切片,缺点：容易形成冰晶，切片较厚，1040m，构造清晰度不如石蜡切片,防止冰晶形成的方法：,高渗蔗糖溶液处理：20%-30%蔗糖PB溶液浸泡13天，组织块沉底,速冻：放组织块入-80C干冰或-196C液氮中速冻，或者将组织块固定在将温度已经下降到-50C的冻头上速冻,* 速冻前组织块都经过高渗蔗糖浸泡过,过程：开机预冷-组织包埋用OCT包埋组织于切片托上-切片-贴片-枯燥-保存如长期保存可存放于-20C，如短期可室温放置，但防尘,二、标本的制备,4. 切片section,二、标本的制备,(2) 冰冻切片恒冷箱切片机：,(3) 振动切片：,利用振动切片机的振动，使刀片横向往复切割，将组织切成薄片,优点：因组织不冷冻，无冰晶形成，染色前又防止了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，故能较好地保存组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，标本可以是经过固定的或者新鲜的少数情况下,缺点：切片较前两种方法厚，20400m，构造清晰度较差,二、标本的制备,4. 切片section,4. 切片,(4) 防脱片处理：,A. 载玻片和盖玻片的处理,黏附剂的使用,- 蛋白甘油,- 铬矾明胶液 ：铬矾0.05%、明胶0.5%和叠氮钠0.01%,- 多聚赖氨酸：0.010.05%,C. 直接购置已经制备好的防脱片载玻片,二、标本的制备,5. 非切片标本制备,无需切片即可制成标本的制备方法，包括细胞涂片、别离组织、组织磨片、整体封存、组织铺片等,细胞涂片：如血涂片,组织别离标本：化学溶解法或者酶消化法,组织磨片法：骨磨片,整体封存标本：早期鸡胚、运动终板等,组织铺片：结缔组织铺片,二、标本的制备,6. 标本封固,标本经过染色等系列处理后，需封固，即将盖玻片和载玻片粘在一起，方便照相和保存,含水封固剂：甘油、甘油明胶、液体石蜡用于整体标本的封固，Clear-Mount不需盖玻片,优点：无需脱水，因此不导致组织收缩变形,缺点：失水导致封固剂干缩，封固不牢,无水封固剂：天然树胶、人工合成树胶中性树胶,优点：封固结实，长期保存,缺点：切片必须彻底脱水和透明，可能导致组织收缩，二甲苯有毒，必须在通风橱内操作,二、标本的制备,7. 组织芯片tissue chip技术,又称组织微阵列，是生物芯片的一种，将千百个组织标本整齐有序的排列在固相载体上，制成缩微的组织切片，结合免疫组织化学、原位杂交等技术，对多种不同生物组织同时进展形态构造比较、基因和蛋白表达水平的定位检测,优点：大样本高通量，高效性，平行性和实验误差小,问题：人体标本石蜡组织库的建立，组织芯片制备的标准化，组织芯片的自动化分析,二、标本的制备,8. 显微切割 技术microdissection,在显微状态或显微镜直视下，通过显微操作系统，从组织切片或者细胞涂片中切割别离欲研究的材料，如组织、细胞群、单个细胞及细胞内组分或者染色体等,二、标本的制备,激光捕获显微切割系统操作步骤,A，准备组织；B，定位细胞；C，放置带有EVA膜的收集盖；D，激发激光；E，别离目的组织；F，下游实验分析,非接触式激光显微切割方法,- Leica Laser Microdissection,A,，划定目标区域；,B,，控制激光沿切割线移动；,C,，目的样品通过重力收集,生物燃料将无色的组织和细胞染上不同的颜色，便于显微镜观察，广泛应用于组织学和病理学等学科,苏木精-伊红HE染色hematoxylin-eosin staining,染色原理：苏木精为碱性染料，使细胞核和胞质内的嗜碱性物质染成紫蓝色，伊红为酸性染料，使胞质中的嗜酸性物质染成红色或粉红色,石蜡切片HE染色步骤：,脱蜡二甲苯：充分彻底,梯度酒精水化,100%I-100%II-95%-80%-70%-水,苏木精染色,时间根据情况而变化,三、常用组织学染色技术,苏木精-伊红HE染色hematoxylin-eosin staining,(2) 石蜡切片HE染色步骤：,水洗：,用自来水洗，弱碱性，加强苏木精的着色,分色：,将过度染色和无需染色的局部去掉，70%酒精配制的0.5%1%盐酸处理数秒，使细胞核和细胞质显示清晰，比照明显,蓝化：,如果分色后染色较弱，可入0.5%1%氨水中蓝化,伊红染色：,切片在0.5%1%伊红中染色23分钟，自来水洗去多余的染液。伊红染色切忌过强，水洗要快速,三、常用组织学染色技术,苏木精-伊红HE染色hematoxylin-eosin staining,(2) 石蜡切片HE染色步骤：,脱水：,用梯度酒精脱水，70%-80%-95%-100%I-100%II，浓度低的酒精有脱色作用，时间不能长，高浓度酒精中时间要足够，脱水要彻底,透明：,切片入二甲苯I、II中各10分钟，将酒精置换出，并且使切片清澈透明，切记在通风橱中操作,封片及镜检：,滤纸吸干组织周围的二甲苯，滴加中性树胶，盖上盖玻片，防止形成气泡，显微镜观察，切片平放，自然枯燥,三、常用组织学染色技术,苏木精-伊红HE染色hematoxylin-eosin staining,三、常用组织学染色技术,结果观察,2. 神经组织镀银染色,将固定后的组织或切片浸于银溶液中，再用复原剂出来，使银颗粒附着在组织构造上，使之呈现出深棕色或者黑色,亲银性：某些组织如神经组织经硝酸银处理后可使硝酸银复原，这种性质即亲银性,嗜银性：有些构造如网状纤维不直接复原银，需参加复原剂才能显示银颗粒，为嗜银性,神经纤维镀银改进法染色：,(1) 试剂：20%硝酸银，氨银液硝酸银-无水乙醇-氢氧化铵，0.2%氯化金，5%硫代硫酸钠，丽春红酸性品红溶液，1%磷钼酸，淡绿液淡绿和冰乙酸,三、常用组织学染色技术,2. 神经组织镀银染色,神经纤维镀银改进法染色：,(2) 染色步骤：略,(3) 结果观察,三、常用组织学染色技术,四,、常用一般组织化学技术,化学反应,化学,试剂,+,拟检,物质,反应产物沉淀,（有色）,（组织,切片或细胞涂片）,（拟,检物质所在处）,组织化学的根本原理,组织原位，特异性的化学反响，显微镜观察,对组织或者细胞内特定物质进展定性，定位， 定量分析,组织化学的根本特点,碳水化合物组织化学技术以PAS反响为例,碳水化合物也称为糖类化合物，常含有一个醛基或者水解后产生醛基，组织构造内以黏多糖最常见，中性黏多糖可用过碘酸-雪夫periodic acid-Schiff，PAS反响显示，酸性黏多糖可用阿利新蓝alician blue，AB反响显示,原理：过碘酸为强氧化剂，可氧化黏多糖产生游离醛基，与Schiff试剂中无色的亚硫酸品红反响，生成紫红色沉淀物，根据沉淀物的位置和颜色的强度判断黏多糖的分布部位和含量的多少，但是要注意控制好氧化时间，过碘酸的pH值以3.05.0为佳,* 固定剂不能选用醛类固定剂尤其不能选用含两个醛基的固定剂，常用Carnoy固定液无水乙醇-氯仿-冰乙酸,四、常用一般组织化学技术,2. 脂类组织化学技术以油红O染色法为例,脂类是构成细胞构造的重要化合物，酸性脂类包括脂肪酸和磷脂等，中心脂类包括甘油三酯、胆固醇及固醇脂、类固醇及糖脂等。,常用甲醛钙固定，甲醛不能直接固定脂类，但是可固定脂类周边的蛋白质，钙离子有利于保存磷脂，固定时间不宜超过10 min；,常用冰冻切片为什么不能使用石蜡切片？；,油红O染色法物理显色法中的一种：,原理：油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合形成小脂滴。染液入组织中，染料染料在溶剂中的溶解度小于在脂类物质中的溶解度可溶解于组织中的脂类中，使组织中的脂滴染成红色,四、常用一般组织化学技术,3. 酶组织化学技术,酶是体内特殊的蛋白质，每种酶可以催化特定的化学反响。用组织化学的方法在一定条件下参加酶的底物，底物在酶的催化作用下产生了反响产物，根据反响产物的分布及量可检测酶的分布和活性。为了不损失酶活性，审慎选择固定方法,四、常用一般组织化学技术,酶特异性底物,+,相关捕获剂,酶,（孵育液内）,（组织细胞内）,镜下观察,有色沉淀,反应产物沉淀,（,有色,）,反应产物沉淀,（,无色,）,+,置换,剂,1根本原理,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2常用显示方法,偶联偶氮色素法：又称偶氮色素法，用某种人工合成底物在酶作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反响，形成不溶性偶氮色素,A. 同时偶联法：该法是孵育液中的底物被酶分解后所产生的反响物沉淀立即与重氮盐形成重氮化合物的偶氮色素而显色,B. 后偶联法：该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解产生反响物沉淀，然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素而显色,+,OPO,2,Ca,OH,OH,-,磷酸萘酚,-,萘基氯化重氮盐,不溶性,偶氮色素,N,=N,OH,酶作用,N,N,Cl,偶联偶氮色素法：,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2常用显示方法,金属-金属盐显示法 : 金、银、铜、铁、铅、钴等金属本身或其盐和化合物具有颜色，容易发生呈色反响，酶的分解产物与这些金属结合，呈现颜色,A. 钙-钴法：,R-PO,4,Na,2,+,H,2,O,R-OH,+,CaHPO,4,CaHPO,4,Co,3,(PO4),2,Co,3,(PO4,),2,CoS,（显色）,CaCl,2,酶作用,Co(NO,3,),2,(NH,4,),2,S,（无色沉淀）,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2常用显示方法,金属-金属盐显示法 : 金、银、铜、铁、铅、钴等金属本身或其盐和化合物具有颜色，容易发生呈色反响，酶的分解产物与这些金属结合，呈现颜色,B. 铅法：,R-PO,4,Na,2,+,H,2,O R-OH,+,PbHPO,4,PbHPO,4,PbS,（显色）,酶作用,Pb,2+,(NH,4,),2,S,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2常用显示方法,色素形成法,:,在酶的作用下，无色的化学物质在局部形成有色的色素沉着。有四种类型,A.,四,唑盐法,：,显示脱氢酶,C,6,H,5,C,N,NC,6,H,5,N,NC,6,H,5,酶作用,+2H,C,6,H,5,C,N,NHC,6,H,5,N,NC,6,H,5,+,HCl,四唑盐,(,无色,),甲月朁 红色,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2常用显示方法,色素形成法 : 在酶的作用下，无色的化学物质在局部形成有色的色素沉着。有四种类型，,B. 靛酚蓝法：检测氧化酶,C. 靛蓝形成法：显示磷酸酶和酯酶等,D. 联苯胺色素法：主要用于证明过氧化物酶，过氧化物酶作用于过氧化氢，释放出原子氧，后者将无色的联苯胺氧化成有色的多聚体沉淀物，沉淀于酶所在的部位,免疫组织化学法：酶是蛋白质，可用相应的抗体检测，检测的主要是酶的表达，而不能等同于酶的活性详见免疫组织化学技术,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,3过氧化物酶组织化学技术,原理：过氧化物酶作用于过氧化氢底物，释放出原子氧，后者将无色的联苯胺二氨基联苯胺DAB或者四甲基联苯胺TMB氧化成多聚体有色沉淀，DAB被氧化成棕色沉淀，TMB被氧化成深蓝色沉淀，位于酶所在的部位,孵育液：含DAB、Tris-HCl缓冲液及H2O2,* 孵育液使用前混合,对照实验：参加酶的抑制剂氰化钾或者叠氮钠,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,4琥珀酸脱氢酶SDH组织化学技术,原理：SDH是线粒体呼吸链的第一个酶，是三羧酸循环的标志酶，也是线粒体的标志酶，可用硝基蓝四唑盐法显示，SDH以黄素蛋白为辅基，将琥珀酸氧化为延胡索酸并释放出氢，后者将淡蓝四唑NBT复原为蓝色的甲月朁,孵育液：含NBT，二甲基亚砜DMSO，琥珀酸和0.1MPB缓冲液,*SDH对固定敏感，最好新鲜标本经冰冻切片后，2%甲醛固定5min，如果是必须固定的组织，建议降低固定液浓度，缩短固定时间,*先用DMSO溶解NBT，再参加琥珀酸和磷酸缓冲液,对照实验：不加底物或者参加酶的抑制剂丙二酸盐,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,5酸性磷酸酶ACP组织化学技术,原理：ACP是溶酶体的标志酶，显示方法多采用金属法中的铅法。,孵育液：含乙酸盐缓冲液，蔗糖，硝酸铅，-甘油磷酸钠,* ACP对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛固定10min,*先将-甘油磷酸钠溶解于缓冲液，后缓慢滴加硝酸铅，不停搅拌，或者将前面三项物质混合溶解，少量屡次逐渐参加-甘油磷酸钠，孵育液过滤后使用，注意pH值,对照实验：孵育液中参加酶的抑制剂氟化钠,R-O-PO,3,Na,2,R-OH,+,H,3,PO,4,(,-,甘油磷酸钠,),H,3,PO,4,+,Pb,2+,Pb,3,(PO,4,),2,Pb,3,(PO,4,),2,+,(NH,4,),2,S,PbS,(,棕黑色,),ACP,pH 5.0,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,6碱性磷酸酶ALP组织化学技术,原理：ALP在碱性环境下pH9.29.4可催化酚和醇的磷酸酯水解，并转移磷酸，多分布于细胞膜运输活泼的细胞。显示方法有钙-钴法和偶联-偶氮色素法两种。钙-钴法的原理为，碱性环境下，底物-甘油磷酸钠在ALP作用下产生磷酸，与钙形成无色的磷酸钙沉淀，参加硝酸钴，形成仍然无色的磷酸钴沉淀，最后用硫化铵处理，形成棕黑色的硫化钴沉淀,孵育液：含氯化钙，巴比妥钠，-甘油磷酸钠，硫酸镁,* ALP对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛固定10min，* 注意pH值,对照实验：不加底物或者参加酶的抑制剂L-四唑咪,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,7乙酰胆碱酯酶AchE组织化学技术,原理：将乙酰胆碱盐水解产生硫胆碱，进而复原铁氰化物为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜棕色沉淀,孵育液：含乙酰硫代胆碱碘盐，乙酸缓冲液，柠檬酸钠，硫酸铜，铁氰化钾,* 对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛,固定20min,对照实验：不加底物或者参加酶的抑制剂毒扁豆碱,硫酸酯,碘化乙酰硫代胆碱,+,H,2,O,硫代胆碱,+,醋酸,硫代胆碱,+,铁氰化物 亚铁氰化物,亚铁氰化物,+,Cu,2+,亚铁氰化铜 ,(,棕褐色,）,AchE,pH 5.5,L-,精氨酸,NADPH,（,介导,）,NOS,L-,瓜氨酸,+ NO +,电子,电子,NADPH,（,传递,）,硝基四唑蓝,（,N-BT,）,甲,月,替,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,8一氧化氮合酶NOS组织化学技术,对照实验：不加底物或者参加酶的抑制剂N-亚硝基精氨酸预孵育,NOS是一种重要的连接酶，NO是一种神经递质、细胞间信使、内皮源性的松弛血管的介质，但是极不稳定，常用NOS的活性来判断NO的分布和量，而NOS与复原型辅酶II-黄递酶NADPH-d的化学构造和组织定位高度一致，常用NADPH-黄递酶法显示NOS,3.,酶组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,9酶组织化学染色本卷须知,标本制备：组织的准备和切片的制作不能影响酶的活性和分布,温度：任何酶促反响都有相应的最适温度,pH值：各种酶促反响具有各自适宜的pH值范围,孵育液各成分的浓度：酶反响速度受孵育液内参与反响的各种成分底物、捕捉剂、激活剂、抑制剂等浓度的影响,激活剂：激活剂是能使酶活性增强的物质。检测某些活性较低的酶时，应使用激活剂增强酶的活力,抑制剂：抑制剂系指某些物质在不引起酶蛋白变性情况下，使酶活性减弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失的物质。抑制剂主要分为非特异性、特异性和竞争性三类,对照实验：酶的抑制剂；不加底物；阳性对照,4.,核酸组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,1Feulgen反响,原理：DNA在酸性环境下水解，嘌呤-脱氧核糖间的糖苷键翻开，形成醛基，与无色的Schiff试剂反响，形成紫红色反响沉淀产物,* 不能用新鲜标本含有缩醛磷脂，导致非特异反响，需经Carnoy固定液固定后石蜡切片；,* 处理时间不能过长，会导致DNA完全水解，反而不能显示,* Schiff试剂中的SO2易逸出，要用棕色瓶并塞紧瓶盖低温保存,对照实验：不加底物或者参加酶的抑制剂毒扁豆碱硫酸酯,核酸nucleic acid是生物遗传物质根底，包括DNA、RNA，前者分布于细胞核，后者分布于核仁和胞质的核糖体内。主要介绍Feulgen反响和三种常用的荧光素染色法,4.,核酸组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2DAPI染色,原理、特征及应用：特异性荧光染料DAPI4,6-二氨基-2-苯基吲哚对DNA双链具有很强亲和力，能与双链DNA小沟结合，结合后荧光增强20倍，而与单链DNA结合无荧光增强，与RNA结合荧光增强也不如双链DNA；DAPI具有膜通透性，可区别未经固定的活细胞较弱的蓝色荧光和凋亡细胞产生很强的蓝光染色，DAPI的荧光强度较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；广泛用于流式细胞术、荧光显微镜和微孔板高通量荧光分析；因为是蓝光，可以与FITC、GFP或Texas Red等荧光染料合用进展多参数分析，DAPI也用于检测细胞培养体系中的支原体或病毒DNA,4.,核酸组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,2DAPI染色,DAPI储存液：0.1mg/ml 溶于0.01MPBS,DAPI工作液：0.1g/ml，用0.01MPBS稀释,染色步骤：,培养的单层细胞(未固定)或新鲜组织的冰冻切片等，PBS漂洗5 min；,DAPI工作液室温染色520 min可根据实验材料的染色结果而定；,PBS漂洗；,水溶性封片剂封片，游离细胞也可直接用含DAPI 的PBS封片；,荧光显微镜或共聚焦显微镜观察照相,4.,核酸组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,3Hoechst染色,原理、特点及应用：可与DNA分子结合，为非嵌入性荧光染料，在活细胞中DNA的AT序列富集区域的小沟处与DNA结合，活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料, 从而使细胞核着色为蓝色荧光。Hoechst可穿过细胞膜，可用于流式细胞术分析细胞周期和监测DNA凝集, 在活细胞和固定的细胞中均适用。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst33258的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，Hoechst33258与之结合增强，染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞那么不被染色,染色步骤根本同DAPI,Hoechst33258,染色示,C6,细胞株细胞核,4.,核酸组织化学技术,四、常用一般组织化学技术,3碘化丙啶PI染色,原理：PI可嵌入核酸的双链，与核酸结合后荧光强度会增强2030倍，为红色荧光,特点：PI不能穿入完整的活细胞膜中，即正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对PI拒染，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合。,应用：可与Hoechst联合使用来鉴别坏死、凋亡和活细胞。正常活细胞对染料有拒染性，蓝色和红色荧光均较少；凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，表现为强蓝色荧光，弱红色荧光；坏死细胞由于有很强的PI嗜染性并可覆盖Hoechest染色，故呈弱蓝色强红色荧光。如果对活细胞染色检测细胞周期必须在染色前进展固定，以增加细胞膜对染料的通透性,Hoechst,染色,PI,染色,A,和,B,融合图像,细箭示正常细胞，粗箭示凋亡细胞，箭头示坏死细胞,5. 凝集素组织化学技术,原理及特点：,- 凝集素 (lectin)是一种无免疫原性蛋白质，具有凝集红细胞的特性，故又称植物血凝素,- 能识别糖蛋白与糖多肽中的碳水化合物，特异性地与糖蛋白中的糖基反响，凝集素亲和层析已成为近年别离纯化糖蛋白的重要手段,- 凝集素具有多价结合能力，能与多种标记物结合，可作为组织化学的特异性探针在光镜或电镜水平显示其结合部位，广泛用于糖蛋白的性质、分布以及正常细胞更新过程中糖蛋白变化的研究,凝集素的标记物：,- 荧光素，辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、生物素等,- 已有上述标记物标记的商品出售，应用时可直接购置,四、常用一般组织化学技术,5. 凝集素组织化学技术,荧光素标记凝集素的组织化学：,用荧光素标记凝集素,染色程序：,组织切片经脱蜡处理，冰冻切片直接进入下一步；假设是Bouin液固定的组织，用70乙醇洗3次去除组织切片内的黄色后，再用蒸馏水漂洗；,PBS漂洗(含1牛血清白蛋白)2次，每次5min；,参加FITC-凝集素 (PBS适当稀释)，置湿盒内孵育，室温l h；,PBS漂洗3次，每次5min；,水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。,结果：FITC标记的凝集素能直接与组织细胞内的糖基结合，从而显示糖基的位置，可用于检测组织细胞中的糖成分，阳性部位呈黄绿色荧光,四、常用一般组织化学技术,示大鼠脊神经节中小型神经元中凝集素结合位点,