男性不育试验室诊断及评价南京医科大学

单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,男性不育的实验室诊断及评估,南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民,维持男性生育的基本条件：,（1）睾丸内产生足够数量的精子。,（2）精子在男性生殖管道内获得运动能力和,受精能力，既精子的成熟。,（3）输精管道通畅。,（4）具有正常的性功能。,（5）附属性腺功能正常。,不育症诊断的步骤：,1.病史采集: 包括年龄、职业、生育史、疾,病史、家族史等。,2.体格检查：包括外生殖器和全身体检。,3.实验室诊断,4.特殊检查,一、 精液常规分析,精子,（5%）,精液组成 精囊腺液（60%）,凝固因子,、,果糖,精浆,（95%）前列腺液（20%）,液化因子,尿道球腺液（3%）,睾丸液、附睾液 ,精子,精液分段成分：,前段,睾丸液，附睾液（精子），尿,道球腺液,中段,前列腺液,后段,精囊腺液,精液变量的参考值：,精液量,：26ml,颜色,：灰白,液化时间,：60分,粘稠度,：拉丝60%,活力,： A+B50%或A25%,精子计数,：2000万/ml,畸形率,：30%,脓细胞,：,5个/HP （6ml,病因：附属性腺感染附属性腺功能亢进,2.,精液液化及粘稠度异常,精液不凝固或凝固不全,：精液稀薄，流动性大。,病因：精囊腺炎症,精液不液化或液化不全,：液化时间30分,病因：前列腺功能障碍,3.,精液pH异常,：,测量方法：pH试纸(pH范围6.1-10.0 或6.4-8.0),pH过低,：,原因：输精管和精囊腺的缺如,附睾病变,pH过高,：,原因：精囊腺液分泌过多,前列腺液分泌过少,4.,精子记数异常,：,正常2010,6,个/ml,测定方法：血球计数板一次性精子计数板,Makler精子计数板CASA仪,1),少精子症,：2010,6,个/ml,严重少精子症,：25010,6,个/ml,5.,精子畸形：,观察方法,：吉姆萨染色法或瑞士染色法,巴氏染色法,布赖恩利什曼染色,肖尔染色法,畸形分类,：头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头，,无定形头，空泡样头，双头等。,颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。,尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等,胞质残余体：常位于精子颈部,白细胞检查：,正甲苯胺蓝过氧化酶染色法：,结果：白细胞染成棕红色,联苯胺法：,染料：联苯胺玫瑰红,结果：白细胞褐色；其它细胞品红色。,二精子运动特性的检测和分析,1.,显微镜观察：,注意事项：,(1)取精液10 ul，滴于玻片，盖上2222盖玻片，静置1,分钟后观察。,(2) 控制温度，最好在37进行,(3) 每次观察46个视野，计算100个细胞，计算A级、,B级、C级和D级精子的百分比，连续观察两张滴片，,误差不得10%。,2.,多点曝光技术,：在1秒钟内对精子连续曝光6次，可判断精子的运动速度及运动轨迹。,精子运动速度分布：,快速： 25微米/秒,中速： 1025微米/秒,慢速：50个/HP或,A级精子20个HP,影响因素,：女方的内分泌状况。,宫颈粘液中的白细胞。,阴道pH，7PCT异常。,宫颈结构异常。,抗精子抗体影响。,性功能异常,如阴道痉挛。,精子质量差。,2),体外试验,：,玻片试验,精子宫颈粘液接触试验,毛细管试验:,穿透介质: 人宫颈粘液;,宫颈粘液代用品: 牛宫颈粘液;,含人血清精子营养液;,含牛血清白蛋白精子营养液;,鲜鸡蛋清;,精子顶体酶测定,（明胶膜法）：,1),制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4湿盒备用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分钟。,2),精子处理：取液化精液，用PBS稀释至2410,6,个/ml。,3),涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37湿盒2小时。,4),观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。,5),正常值：平均反应率65%，平均反应直径25m。,6去透明带仓鼠卵穿透试验,1),精子准备：,精液充分液化,调整精子浓度至1010,6,个/ml,ml，5%CO,2,，95%空气中，,37孵育1824小时，调整精子浓度至410,6,/ml。,2),卵细胞准备：,取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG 3040U，4872,小时后再次注射HCG 3040U，18小时后输卵管内取卵。,1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。,3),体外受精：,ml精液加至液体石蜡下，再加入2030个仓鼠卵，培养3小时。,4),结果观察：,相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为10%。,三,精液生化指标检测,1.,酸性磷酸酶测定,（ACP）,原理：P硝基酚磷酸二钠,ACP,P硝基酚,测定产生的P硝基酚含量，推测ACP的活性,正常值：200U一次射精,意义：反映前列腺功能,2.,果糖测定,：间苯二酚法,原理：果糖间苯二酚,加热,红色化合物,测定化合物含量,g/L,意义：反映精囊腺功能与精子供能有关,3.,糖苷酶测定,原理：麦芽糖,糖苷酶,葡萄糖,测定葡萄糖含量,U/ml,意义：反映附睾功能,四抗精子抗体测定,1.,常用方法：,1),凝集试验,：,原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。,试管玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）：,将待检样本与液化的精液混合后，于孵育小时，显微镜下观察，出现条以上精子头头、尾尾或头尾连接即为凝集，观察个视野，个以上出现凝集即为阳性。,圆盘凝集试验,（Friberg）,凝胶凝集试验,（Kibrick）,缺点：假阳性高,2),精子制动试验,（Isojima）：,原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。,缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。,3),直接免疫荧光试验,：,原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。,优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。,4),免疫珠试验：,原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。,优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。,5）混合抗球蛋白抗体试验（MAR试验）：,原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA.,6),酶联免疫吸附试验,（ELISA）：,原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有AsAb则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与AsAb结合，最后加入底物，产生颜色反应。,优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定阳、阴性对照。,五激素测定,六遗传检测,（一）,染色体检查,染色体的非整倍体,）性染色体的非整倍体,精子发生需要性染色体的平衡，即一个X和一个Y，X或Y的数目异常均可导致精子发生异常。,(,1) 47,XXY男性（Klinefelters syndrome），发生率1：500，睾丸发育不良，精子发生障碍；46,XY/47,XXY亦经常发生，伴有无精子或少精子。,(2) 48,XXXY，49,XXXXY表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。,(3),46,XX男性：由于Y染色体的短臂（Yp11）异位到X染色体的短臂上（Xp22）。内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位，Yp11远端（SRY附近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。,(4) 45,X男性，较少见，为Y长臂缺失，短臂异位至常染色体上（13,15,22常见）。,(5),47,XYY发生率1：750，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异常染色体，4575%精母细胞带有二个Y。,(6) YA平衡异位：Y长臂远端的异染区（Yq12）转移至端着丝粒常染色体的长臂上，Y长臂断裂在Yq11上，断裂部位对精子发生的影响较大，距Yq11较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距Yq11较远时，精子发生可正常并能生育，但带有YA异位的很易再断裂而引起不育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。,2) 常染色体的非整倍体,在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力男子的10倍。,(1) 男性Turner氏综合征（Noonan 综合症）：,为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为46, XY，或XO/XY嵌合体。,临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷，隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降，FSH和LH升高。,21三体（Down综合症）：可生育或不育，多余的一条21可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（Sex vesicle）的形成。,、3、9、10染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转，性腺退化，生精障碍。,罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。,体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现1号染色体的非整倍体和XY精子的发生率是体细胞的10倍，如用XY精子行ICSI则可产生47,XXY的后代。已有报道，ICSI的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因此对行ICSI的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前胚胎的遗传分析。,（二）精子发生基因（Azoospermia factor, AZF）检测,1.,AZF存在部位：,2. AZF的重要候选成分：YRRM1, DYS240, DAZ,3. AZF与精子发生的关系：,精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于500万ml）约有有AZF缺失,4. AZF的检测方法：,(1),染色体原位杂交法,(2),Southern Blot方法,(3),PCR方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特点，便于临床推广应用，多重PCR可同时检测几AZF成分。,(4),单链构象多态性分析（Single Strand Conformation analysis, SSCP）检测AZF的点突变。,(5) 核苷酸序列测定,(6) 基因芯片技术,5. AZF检测的意义：,(1),从基因水平揭示精子发生的机制。,(2),无精子症和严重少精子症患者的病因诊断。,(3),ICSI的病例选择。,(4),为基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基础。,