结核病诊断TSPOT 实验

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,结核病诊断 TSPOT 实验,目录,01.,分枝杆菌概述,02.,结核病实验室检查,03.,小结,2,分枝杆菌概述,01,3,分枝杆菌属分类,结核分枝杆菌,(M.tuberculosis),非结核分枝杆菌（,NTM,）,麻风分枝杆菌（,）,4,结核分枝杆菌的发现,1882,年 德国柯赫医生发现结核致病菌,-,结核杆菌,5,结核杆菌的变迁,1897,年提出结核病的飞沫传播,1922,年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种,1945,年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。,6,结核分枝杆菌,特点,(M.tuberculosis),生物学主要特点：,1. 细胞壁中含有大量,脂质,慢性,并伴肉芽肿,3.,抗酸染色阳性,7,结核病,由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病,8,结核病,临床表现,症 状,体 征,1.,全身症状：消瘦、盗汗、低热、乏力,2.,呼吸系统症状：咳嗽、约,1/3,咯血,3,结核变态反应表现,因肺结核好发于肺上叶尖后段及下叶背段，故锁骨上下、肩胛间区叩诊音浊,9,结核病发病机制,起始,期,细胞外增殖期和传播期,共生期,T,细胞反应期,10,结核病发病机制,结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，,不留任何痕迹和感染证据。,特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答,起始期,结核分枝杆菌在体内复制，形成感染灶，由,T,细胞介导的细胞免疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。,特点：激活体内免疫反应（,CMI,和,DTH,），宿主获得抗结核抵抗力,反应期,11,结核病发病机制,在低氧、低,pH,、抑制性脂肪酸和宿主免疫机制共同作用下抑制细菌的增殖。结核分枝杆菌未被完全清除，细菌和宿主处于共生状态，结核杆菌主要存在于坏死组织中央。特点：可激发和维持,T,细胞的免疫记忆，在一定条件下再次发病,共生期,长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起结核病,特点：结核播散,增殖,传播期,12,接触活动性结核病患者,暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除,没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能,被检测,X-,光,/ CT,扫描显示正常,没有抗体应答,诊断困难,传统的结核感染检测只有,TST,（,PPD,）,机体被感染,受机体免疫力抑制,没有临床症状,终身处于感染状态,潜伏感染,有临床症状,具有传染性,结核杆菌可以通过涂片、培养检测出,胸部的,X-,光或,CT,扫描显示异常,肺外结核难以诊断,(,特别是儿童,),活动性结核,5%,5%,再次激活,活动性结核与潜伏感染,13,结核病,诊断,实验室检查,影像检查,病理检查,+,临床 指征,14,结核杆菌实验室检查,02,结核诊断,-,临床应用,几乎所有的临床内科科室都需要结核的鉴别诊断：,发热待查，结核排筛,结脑的鉴别诊断,胸腹水患者待查,儿童结核,16,结核杆菌,结核病,实验室检,查,细菌学检查,免疫学检查,分子生物学检查,分枝杆菌分离培养,分支杆菌药敏试验,分枝杆菌菌种鉴定,体液免疫学诊断,细胞免疫学诊断,DNA,测序,DNA,探针技术,聚合酶链反应（,PCR,）,17,结核分枝杆菌,-,实验室检查,涂片镜检,细菌学检查,适用于多种标本；操作简便，价格低廉。,2,份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；,1,份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性,+,肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。,肺结核治疗评估的主要依据之一,18,结核分枝杆菌,-,实验室检查,缺点：,不能区别是否为非结核分枝杆菌,不能区别死活菌。,结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。,检测灵敏度较低（,10,4,-10,5,个细菌,/,毫升）,。,19,结核杆菌培养,细菌学检查,传统方法：,L-J,固体培养基,快速培养法,:,检测细菌生长过程中代谢产生的,CO2,或消耗的,O2,，显微镜直接观察、变色液体培养基等,BACTEC MGIT960,系统,BACTEC460,系统、,Bact/ALERT 3D,、,ESP,等。,痰培养、其他标本培养,20,结核杆菌培养,阴性培养,阳性培养,无或微弱荧光,F,F,FO,2,FO,2,FO,2,FO,2,FO,2,F,FO,2,FO,2,CO,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,CO,2,CO,2,O,2,F,F,F,F,FO,2,FO,2,F,F,F,F,CO,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,强荧光,传感器,对氧气高度敏感的钌复合物,肉汤,改良,Middlebrook 7H9,肉汤,上部空间,已预先充填,10% CO,2,BACTEC,MGIT,960/320,指示器系统,21,结核杆菌培养,1,份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性,+,1,份痰标本结核分枝杆菌培养,痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现,+1,份痰标本结核分枝杆菌培养阳性,用于耐多药结核疗效判定,结核菌培养临床价值,确诊结核,22,抗酸杆菌培养优缺点,敏感性较直接涂片法高，理论上,10-100,条菌,/,毫升可检出阳性；,特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；,分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。,需时长,，根据接种量的大小，一般,2-8,周才能得到肉眼可见菌落。,结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响，,操作,较直接涂片法,复杂,，需经严格培训 。,需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等,设备,。,成本,是直接涂片法的,7-8,倍。,23,细胞免疫学检查,结核菌素皮肤试验（,PPD,试验）,干扰素释放试验（,T-SPOT,试验）,24,免疫学检查,细胞免疫学检查,PPD-,结核菌素试验,迟发型细胞超敏反应,1,）方法：,1:2000 OT,或,PPD,液毫升,(5,单位,),，,左前臂屈侧中部,皮内注射，,48-72h,测量皮肤,硬结,的直径,。,25,PPD-,结核菌素试验,2,）,判断标准,：,阴性,4mm,弱阳性,5-9mm,阳性,10-19mm,，,强阳性,20mm,或局部出现水泡与坏死,26,PPD-,结核菌素试验,3),结核菌素试验的意义,阴性,：无结核菌感染；不能排除结核感染。,阳性,：曾有结核感染，并不一定现在患病。,强阳性,：活动性结核病可能,A,、变态反应尚未建立；,B,、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等,27,PPD-,结核菌素试验,PPD,所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，,特异性较差,。,当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果,，,敏感性低,。,免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。,经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。,PPD,试验临床价值,28,T-SPOT,实验,细胞免疫学检查,T-SPOT,试验原理,结核感染者体内存在特异的效应,T,淋巴细胞，效应,T,淋巴细胞再次受到,结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（,IFN-,）。,因此，,检测效应,T,淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。,既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式,将其表现出来。,刺激抗原,：,ESAT-6,蛋白,(,早期分泌抗原靶,6,）,、,CFP-10,蛋白（,培养滤液蛋白）,由结核分枝杆菌特有的,RD1,基因编码,，可刺激活化的效应,T,淋巴细胞产生,干扰素。,RD1,基因在,BCG,以及大部分环境分枝杆菌中缺失。,29,T-SPOT,试验,干扰素,检测阴性,干扰素,检测阳性,TB,抗原多肽,T,细胞,活化,T,细胞,干扰素,30,T-SPOT,步骤,31,T-SPOT,灵敏度,Reference,Sensitivity,Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53,100.0% (12/12),Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*,83.3% (20/24),Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*,96.6% (84/87),Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*,91.3% (21/23),Meier et al EJCMID 2005 24;529-536,95.9% (70/73),Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*,92.2% (59/64),Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8,98.3% (57/58),Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.,90.0% (27/30),Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*,92.9% (26/28),Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703,92.9% (26/28),Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*,80.8% (80/99),Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*,85.7% (36/42),Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9*,94.1% (254/270),Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*,84.6% (11/13),Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8,87.2% (34/39),Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9,100.0% (10/10),Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259,100.0% (22/22),Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624*,100.0% (9/9),Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*,87.5% (42/48),Kobashi et al. J Infect. 2008 Epub ahead of print.*,90.0% (36/40),Domnguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008.* Epub ahead of print,84.2% (32/38),Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*,89.9% (62/69),Bosshard et al. Respir Med. 2008. Epub ahead of print,98.4% (62/63),Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. Epub ahead of print*,95.9% (47/49),TOTAL,92.0% (1139/1238),灵敏度,基本,不受免疫力低下,/,受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率,美国,FDA,数据：灵敏度,95.6%(175/183),国内临床数据：灵敏度,95.3%(624/655),32,结核杆菌,特异性高,只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（,BCG,）无交叉反应,美国,FDA,数据：特异性,97.1%(297/306),国内临床数据：特异性,94.1%(478/508),33,PPD,皮试与,T-SPOT,试验,PPD,皮试,T-SPOT,试验,估计的敏感性,(,活动性结核的患者）,7590%,（,对免疫抑制患者的敏感性进降低明显,）,7595%,（,对免疫抑制患者的敏感性降低不明显,）,估计的特异性（无结核病史或暴露史的健康人）,7095%,（接种,BCG,者的特异性进一步降低）,90100%,（接种,BCG,者的特异性不变）,与,BCG,的交叉反应,存在,存在的可能性较小,与,NTM,的交叉反应,存在,存在的可能性较小,与,M.TB,暴露的相关性,存在,相关性较,PPD,皮试大,阳性结果与随访期间罹患结核的相互关系,中到显著的正相关,无充足的证据,可重复性,中等，但可变,较高，但证据较少,PPD,皮试和,T-SPOT,试验的比较,34,T-SPOT,试验,结果解释,阴性结果,提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞。假阴性结果：,感染阶段不同；少数免疫系统功能不全,/,疾病；实验非正常操作。,阳性结果,提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：,4,种环境分枝杆菌感染时：（堪萨斯）、（苏氏）、（海）、（戈登）,减少了医生主观因素对检测结果的影响,;,故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊断的较为理想的手段。,35,非血液样本检测,T-SPOT,可通过一些体液成功地诊断出活动性结核：,支气管肺泡灌洗液（“,BAL”,）（肺部）,脑脊髓液（,“CSF”,）（中枢神经系统）,胸腔积液（肺部周围）,腹膜液（腹腔）,非血样本的,T-SPOT,结果很强的话（即存在大量的结核效应,T,细胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核,非血样本中不存在结核效应,T,细胞，说明这个器官或部位没有活动性结核,36,各国对潜伏感染风险人群的筛查指南,风险人群,美国指南,加拿大指南,英国指南,免疫力抑制人群（例如，,HIV,感染者，使用强的松或,TNF-,抑制剂治疗）,TST,或,IGRA,；如果是阴性或高度怀疑的，,TST,和,IGRA,都要检查,TST,，如果,TST,阴性要用,IGRA,确认,TST,或,IGRA,BCG,接种者（如果也属于其它风险人群）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,TST,或,IGRA,与传染性肺结核患者密切接触,TST,或,IGRA,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,医务工作者,TST,或,IGRA,推荐用,TST,TST,或,IGRA,，视情况而定,无法再来确认,TST,结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,推荐用,IGRA,37,小结,03,小结,结核病诊断金标准：,抗酸杆菌培养,-,阳性,病理结果,-,阳性,辅助手段：,影像学、分子生物学,结核病在临床上仍不容忽视，但诊断仍存在难题,T-SPOT,是结核病早期诊断的较为理想的手段,39,参考文献,韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健.-干扰素释放分析T-SPOTTB在结核性疾病中的诊断价值.临床肺科杂志.2012,17(8):1439-1440,SPOT.TB诊断结核感染临床应用进展.中国医学科学院学报.2009,4:506-510,中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，,2008-08-01,Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.,Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624,Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34,Dominguez et al Clin Vacc,.,Immunol 2008; 15;168-71,Kim et al. Am J Med.2009；122, 189-195,40,Thank you,请各位老师批评指正！,Thank You !,不尽之处，恳请指正！,