高级生化研究技术实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高级生化研究技术,1,实验三 PCR法克隆植物基因组DNA目的基因, DNA抽提的基本原理,先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、,十二烷基硫酸钠（SDS）,等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核中心的核蛋白，并与蛋白质形成混合物；再加入,酚和氯仿,等变性剂，使蛋白变性，经离心除去植物的组织和变性蛋白；上清液中加入,无水乙醇或异丙醇,使DNA沉淀下来。,2,3, 琼脂糖凝胶电泳,分离和纯化DNA片段的最常用技术。一块琼脂糖凝胶即为一个包含电解质的多孔支持介质，当把它置于电场中时，,DNA分子将向阳极移动,，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧有富含负电荷的磷酸根残基。DNA分子电泳过程中，有,电荷效应和分子筛效应,，琼脂糖电泳法分离主要利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。该过程可以通过示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测，分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。,4,5, PCR技术,PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤： 变性（Denature）：目的双链DNA片段在94下解链； 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度（50左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对； 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达10,6,倍。,6,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,7,PCR反应体系的确立,Water,Buffer（10,）,Mg+（25mM）,dNTPs（10mM）,Primer1,（,10uM,）,Primer2,（,10uM,）,Taq（5U/uL）,Templets,12.8,2,1.6,0.4,1,1,0.2,1,128,20,16,4,10,10,2,20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量,PCR扩增程序举例,Tem.,94,94,56,72,72,Time,00:08:00,00:00:30,00:00:40,00:01:00,00:07:00,Cycles,35,8,引物设计,94,72,56,9,三、实验材料与试剂, 材料：,水稻叶/根, 试剂, DNA抽提液：100mM Tris-HCI（pH 7.8），500mM NaCl，25mM EDTA，1SDS；, 10TBE：Tris 108g/L ，硼酸 55g/L，20mmol/L EDTA (pH8.0), TE：10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA；, 3M NaAc（pH 5.2）；, Taq DNA聚合酶（含10PCR buffer）, dNTP, 氯仿：异戊醇（24：1）；异丙醇、无水乙醇、70乙醇等。, 仪器设备,PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、恒温水浴箱、水平电泳槽、移液枪等。,10,四、实验步骤, 植物组织微量基因组DNA的抽提, 取材料约200mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮，将叶片研磨至粉末状。迅速转到1.5mL 离心管。, 加入1mL的DNA抽提液，上下倒转使之混匀，65水浴保温30min。12,000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中。, 加等量的氯仿：异戊醇（24：1），室温上下温和混匀约5min。12，000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中。, 加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000rpm离心10min，倒去上清液。, 500L 70乙醇洗涤2次，风干。用30L 无菌水溶解，置于-20备用。,11, PCR法扩增目的基因,以水稻DNA为模板，分别以PSK-F和PSK-R为上下游引物扩增水稻,osPSK,基因。, 反应体系,在PCR管中依次加入下列试剂：,10PCR反应缓冲液 2 l,dNTP Mixture（2.5mM） 1.6 l,上游引物（5mM） 2 l,下游引物（5mM） 2 l,模板DNA（约10ng） 2 l,Taq 酶（5 U/ l） 0.2 l,加无菌水补充至总体积为20 l 。, PCR反应程序,94将模板预变性5min；94变性40s，54退火40s，72延伸1min，共进行30循环；最后72下保温10分钟，使反应产物扩增充分。,12, DNA的琼脂糖凝胶电泳检测, 制胶：称取琼脂糖0.4g，加入1TBE 50mL，于微波炉中加热至完全溶解。冷却到约60，在凝胶中加入2,L的EB（或替代染料），混匀，倒胶。待胶完全凝固后拔去梳子，转移到装有1TBE的电泳槽。, 电泳：取6,L DNA样品，加入1,L loading buffer，用枪头混匀并点样。开始电泳，电压为45V/cm，电泳约30min。, 观测：把电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外灯（或凝胶成像系统）下观测。,13,14,取6 l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。,15,实验四 植物组织基因组RNA的提取及检测, RNA的基本特点,组成：,A、G、C、U,结构：,单链，容易形成二级结构（变性胶电泳）,种类：,rRNA: 28S, 18S, 5.8S,mRNA,tRNA,稳定性：,不稳定,16, RNA抽提的基本原理,所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中,最关键的是抑制RNA酶活性。,17, RNase及抑制剂,RNase来源,内源：材料,外源： 空气、操作器具、水、人,RNase抑制剂类型, RNasin：竞争与RNase结合（反转录）, DEPC：0.05-0.1%，搅拌过夜再灭菌；不能处理Tris,溶液及乙烯类制品。, NaOH 和H,2,O,2,：0.5N NaOH ，3% H,2,O,2, 异硫氰酸胍：Trizol, 酚/氯仿：蛋白质变性剂,18, RNA变性电泳,RNA的电泳分析与DNA电泳电泳稍有不同。,非变性电泳无法测定RNA分子的相对分子质量，,这是因为单链RNA分子的某些区段含有互补的双螺旋结构，使得在未变性的条件下，RNA的相对分子质量与泳动速率的相关性较差，只有在完全变性条件下，RNA在凝胶中的泳动速率与相对分子质量的对数成线性比例关系。,甲醛电泳,是一种理想的RNA变性电泳方法，甲醛可以与碱基形成具有一定稳定性的化合物，同时也可以降低电泳系统的离子强度，这些都有助于阻止RNA分子互补区的碱基配对，使RNA完全变性,19,高质量的RNA必须满足以下两个条件：较好的完整度和较高的纯度。,纯RNA的OD260 / OD2802.0，由于材料和方法的不同，一般纯化出的RNA OD260/OD280约为1.72.0，若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染，可用酚/氯仿抽提去除。,RNA完整度可通过甲醛变性电泳检测，未降解的高质量的RNA经变性电泳后，两条带的亮度28s：18s应为2：1，有时溴酚蓝前面有一条很浅的条带为5s。,20,三、实验材料与试剂, 材料：,水稻叶片/根, 试剂, Trizol, DEPC处理水：先配0.1 DEPC过夜，然后用1.2Pa高压30min去除DEPC。, 10MOPS：pH7.0，200mmol/L MOPS，50mmol/L NaAc (pH5.2)，10mmol/L EDTA (pH8.0)，4避光保存。, RNA上样缓冲液：500l 甲酰胺，100l 37%甲醛，100l 10MOPS，50l 1mg/ml EB，100l 0.5%溴酚蓝。4保存。, 异丙醇、75乙醇(DEPC处理水配), 仪器设备,低温高速离心机、紫外分光光度计、水平电泳槽、移液枪等。,21,四、实验步骤, 植物组织微量基因组RNA的抽提, 取材料50100mg，放入预冷的研钵中，加入适量液氮将其研磨至粉末状。迅速转到1.5mL 离心管，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10% 。, 加入1mL的Trizol，充分漩涡混合，室温下放置5min。, 加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡离心管15 s后，室温下放置3min。于4，12,000r/min离心5min。, 将含有RNA的上层水相转移到另一离心管中，加入0.5mL异丙醇，-20 下放置10min。于4，12,000r/min离心10min。, 小心弃去上清，加入1.0mL 75%乙醇洗涤沉淀。4，12,000r/min离心5min。弃上清，室温或真空干燥5-10分钟。加入30l DEPC处理水溶解沉淀，并保存于-70。,22, RNA的琼脂糖凝胶变性电泳, 制胶：称取0.5g琼脂糖加入无菌水 40ml，微波炉中加热融化并冷至60后，加入5ml 10MOPS，5ml 37%甲醛，倒胶。, 电泳：取RNA样品约5l ，加入RNA上样缓冲液5l ，混匀，65水浴5min，冰浴冷却后上样。电泳缓冲液为1MOPS，以3-4v/cm恒压电泳，电泳约45 min。, 观测：把电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外灯（或凝胶成像系统）下观察，并照相。,23, RNA的浓度检测,紫外分光光度法：取5,l DNA待测样品，加入2mL无菌水，混匀。于260nm处比色，读值为A，浓度40500A/2 (ng/,L)。同时读取280nm的比色值，如果OD260/OD280值在1.92.0之间，表明纯度良好。,24,