荧光探针

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,| Life Technologies Proprietary & Confidential |,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,| Life Technologies Proprietary & Confidential |,*,荧光探针,（,Fluorescence Probe,）,荧光素类探针,无机离子荧光探针,荧光量子点,分子信标,荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析,定量,PCR,技术以及,DNA,测序,荧光探针,的应用,荧光探针的原理,PPT,模板下载：, PPT,素材下载：, PPT,图表下载：, PPT,教程：, Excel,教程：, PPT,课件下载：, F),，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知,(,颜色变化,),或仪器检测的信号,(,荧光等,),。,连接基团,(S),，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。,(1),结合型荧光探针,(2),置换型,荧光探针,利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂的要求都比较高，既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指示剂，又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子传感器的设计。,(3),化学计量型,荧光探针,化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测的一类探针。,主要包括两种类型：,类是目标离子和探针分子发生化学反应后仍旧通过共价键相连接；,类是目标离子催化了一个化学反应,。,荧光,共振能量转移,(FRET),机理,荧光,共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子,(Donor),和受体分子,(Acceptor),相距一定距离,(,一般为,2-5 nm),，且给体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，处于激发态的给体将把一部分或全部能量转移给受体，使接受体被激发的过程。受体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂。,SYBR Green I,法,结合双链,DNA,分子小沟,延伸结束，形成双链,DNA,，,SYBR Green,结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度,优点,使用方便，无需复杂的设计,成本较低,缺点,与非特异性产物结合，无模板特异性,试验方法较难优化,灵敏度低,TaqMan,探针法,水解型,报告基团，淬灭基团,FRET,（荧光谐振能量传递）,识别特异性产物,优点,特异性高，可准确定量,灵敏度高,设计不同标记的探针，可进行多重检测,缺点,一个探针只适用于一个目标,价格较高,探针设计较繁琐,因为,Fret,机制没有荧光产生,发生水解,fret,机制消失，荧光发生,常规,vs,实时,常规,PCR,：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析,定量,PCR,技术：利用荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析,定量,PCR,常规,PCR,灵敏度高,高精确度,安全省时,只能进行半定量或定性分析,不安全易污染,费时费力,循环阈值（,Ct,）：,PCR,扩增过程中扩增物的荧光信号达到设定值的所经过的扩增循环次数。,Ct,值和荧光阈值,有关。荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环,次数。（,Ct,值相对固定）,荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度,标准。是循环开始,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍，设定在扩增曲线指数增长,期。,荧光强度,-,循环数曲线,初始模板量对数,-C(T),循环数标准曲线,10,4,10,3,10,6,10,5,10,2,10,C(t),与初始模板含量,初始模板量越多，,C(t),值越小,C(t),与初始,模板浓度的对数值成线性关系,实时,荧光,PCR,病原菌检测,实时荧光,PCR,病毒检测,实时荧光,PCR,基因突变和临床,实时荧光,PCR,遗传病研究中应用,实时荧光,PCR,在肿瘤中应用,实时,荧光,PCR,在环境微生物检测的应用,实时荧光,PCR,在肿瘤中应用,利用,TaqMan,法研究,ERBB2,在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（,相对标准曲线法,）,已知在,50%,的乳腺肿瘤样本中，,ERBB2,表达异常，因此可以作为一个检测标准,选用,GAPDH,作为内标基因,FAM,标记的,ERBB2,探针,VIC,标记的,GAPDH,探针,构建标准曲线,双重,PCR,反应,阴性对照,无,RNA,对照（空白）,无逆转录酶对照（基因组）,标准曲线,Color 2,- VIC detection for,GAPDH,Color 1, FAM detection for,ERBB2,样品扩增：正常,vs,肿瘤,PMT1-FAM detection-,ERBB2,PMT2-VIC detection-,GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,正常,稀土荧光探针法,稀土,离子可以与多种有机化合物形成配合物，用合适的激发光激发该稀土有机配合物，配合物中的配体分子可以吸收激发光，然后通过分子内能量转移的方式将吸收的能量传递给稀土离子，从而发射稀土离子的特征荧光。因为稀土离子荧光探针具有斯托克斯位移大、荧光寿命长、发光强度大、选择性好、荧光稳定以及受外界影响小等优点，使一些本来不发荧光，或者量子产率很低的荧光测试成为可能，所以稀土离子荧光探针法成为一种非常重要的定量检测手段。,由于,稀土荧光探针技术的独特优势,使其在药物分析及生物大分子分析方面有了很大发展。本论文利用稀土荧光探针技术建立了哇诺酮类药物及血清白蛋白新的测定方法,并以荧光光度法为研究手段,对药物与血清白蛋白的相互作用进行了研究,主要做了以下工作以稀土离子中铺和试为荧光探针,建立了一种简单而灵敏的测定痕量哇诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于哇诺酮类药物能与稀土离子铺或试形成络合物,发生,分子内能量转移,并发射铺或试离子强的特征荧光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量哇诺酮类药物含量的新方法。利用该方法测定了药物制剂中哇诺酮类药物含量,检测限达到级。由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药物的光谱发生重叠,常常干扰测定。本文采用的稀土离子荧光探针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对哇诺酮类药物荧光的干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中哇诺酮类药物含量的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际样品的测定中,取得了满意的结果。,二酮类配体,芳环,-,多羧酸类配体,大环配体,稀土离子中,Eu,和,Tb,为荧光探针,建立了一种简单而灵敏的测定痕量喹诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于喹诺酮类药物能与稀土离子,Eu,或,Tb,形成络合物,发生分子内能量转移,并发射特征荧光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量喹诺酮类药物含量的新方法。利用该方法测定了药物制剂中喹诺酮类药物含量,检测限达到级。由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药物的光谱发生重叠,常常干扰测定。本文采用的稀土离子荧光探针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对喹诺酮类药物荧光的干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中喹诺酮类药物含量的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际样品的测定中,取得了满意的结果。,第二部分基于血清白蛋白对喹诺酮一铽络合物的荧光增强效应,建立了灵敏检测血清白蛋白的喹诺酮一铽络合物荧光探针。该探针具有高的灵敏度、选择性和低毒性,将其应用于血清样品中血清白蛋白含量的测定,结果令人满意。并探讨了其增敏机理。,利用荧光光谱法和紫外分光光度法研究了四环素类药物米诺环素与牛血清白蛋白的相互作用。用,Stern,Volmer,曲线求出了不同温度下的碎灭常数,讨论了碎灭机理,应用,Farster,型偶极一偶极非辐射能量转移机理,确定了药物与蛋白质的最近距离,并用同步荧光技术考察了米诺环素对构象的影响。,谢谢，敬请指正,