实验九动物骨髓细胞染色体制备

,按一下以編輯母片,第二層,第三層,第四層,第五層,*,按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片,第二層,第三層,第四層,第五層,按一下以編輯母片標題樣式,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验九动物骨髓细胞染色体制备,了解制备中期染色体标本的原理,掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术,观察染色体的数目以及形态特征,一、实验目的和要求,在正常动物细胞中，骨髓是处于不断分裂的组织之一，骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。,二、实验原理,三、实验用品,材料,牛蛙。,2.,器具,:,解剖器具、注射器,(2,m,L),、离心机、刻度离心管、玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅等,。,3.,试剂,:,2 mg/,ml,秋水仙素溶液,、,固定液,(,甲醇：冰醋酸,3：1,),、0.075 mol/,L,的KCl低渗溶液、Giemsa染液、磷酸缓冲液(,p,H 7.2)、0.85%生理盐水等。,1,、,秋水仙素处理,：实验前一天晚上，按照青蛙每克体重,4 ug,的剂量，腹腔注射秋水仙素。,2,、,取股骨,：将牛蛙处死，迅速取出股骨（为了获得较多的骨髓细胞胫骨亦可使用），用剪刀和纱布剥去全部肌肉组织，用骨剪剪开长骨两端的膨大部半透明软骨（,不能全部剪断,），,程度以刚刚露出红色的骨髓组织为宜,。收集前后肢提取,6,根骨头（每组,3,根）。,四、实验步骤,每组同学取前肢、后肢各一，获取长骨,3,根,上肢,1,下肢,2,3,、,取骨髓,：,用2,m,L,注射器吸取生理盐水,2,m,L,，将针头插入骨髓腔，将红骨髓细胞冲入,35 mm,培养皿内，反复几次，直至骨头变白（需将随骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用镊子挑出），将一只牛蛙的所有骨髓细胞集中在一只离心管中，吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。,四、实验步骤,注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞,4,、将骨髓细胞悬液转入,2,只1.5 m,L,离心管中（,等体积，保证离心平衡,），以1,5,00 rpm离心10 min，弃去上清液,.,5、,低渗,：每管加入 m,L,KCL溶液，吸打混合均匀，将两管合并成一管，37,水浴低渗2,5,min。,（细胞膨胀，使滴片时细胞膜破碎，染色体分散）,6、,固定,：将低渗处理后的细胞悬液,2,000 rpm离心,6,min，小心吸去上清液（弃去）,每管加入新鲜配置的甲醇：冰醋酸（3：1）,1 mL,，用移液器将细胞,轻轻,吸打均匀，固定,15,min,。（固定细胞形态，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏）,7、重复上面步骤一次。,8、,2,000 rpm离心,6,min，小心吸去上清液（每管约,900 L,），留少量残液用吹打法将沉淀制备成细胞悬液。,9、,滴片,：在,预先冷冻,，用酒精浸泡的载玻片上，滴加,1-,3滴上层细胞悬液，在烘箱中烘干。,10、,染色,：将玻片平放于支架上，细胞面向上，每片滴加Giemsa染液数滴，染色1,020,min。,11、,镜检,：在自来水管下冲洗数秒，去掉染液，在烘箱中烘干，滴加甘油后盖上盖玻片，显微镜观察。,四、实验步骤,滴片的制作,0.51 m,首先在,10,倍镜下观察标本，应背景清晰，杂质较少，细胞分散良好。,10,倍镜下找到松散的细胞团，类似于线团，其染色比较致密的细胞核颜色浅。,转到,40,倍镜下，应能看到成,X,型的中期染色体，如分散较好的图像可以看清结构并数清其条数。在,40,倍镜下找到清晰图像后，可直接拍照保存，并记录下该图像大致位置,(,载物台上标本移动轴上对应位置,),。,在,40,倍镜下将图像移至视野正中央，再下降载物台，滴香柏油转油镜观察图像，拍照保存。,观察完毕立即清理油镜镜头,!,注意滴了油的载玻片不能在,40,倍镜下观察,!,镜检观察,五、实验结果,优良制片标准,:,单个细胞的染色体较集中，各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中，呈蓝紫色，能清晰显示着丝点位置。,牛蛙染色体,2n=26,牛蛙骨髓细胞染色体核型（,2n=26,）,1、低渗与离心等步骤的操作要轻。,2、低渗处理极为重要，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。,3,、固定液要现配现用，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦收到影响。,4,、载玻片要预冷，冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。,六、注意事项,七、作业,绘制染色体图并作简要分析,。,例如：,细胞密度是否适中,，分裂细胞的比例如何，处于,分裂中期相,的细胞数量情况，,染色体形态,、,数目,、有否,重叠,等。,谢谢！,