蛋白质生物合成

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第9章,蛋白质的生物合成,1,蛋白质的生物合成,（protein biosynthesis）也就是通常所说的,翻译,，通过翻译，核酸分子的4种核苷酸编码的基因语言就会被准确转变成由20余种标准氨基酸编码的蛋白质语言。,蛋白质的生物合成在细胞代谢中占有十分重要的地位，以大肠杆菌为例，蛋白质的含量占到了细胞干重的50%，其种类超过3000种，在细胞周期的20min内合成如此之多的蛋白质，速度是非常惊人的。同时这个过程也是非常复杂的，几乎涉及细胞内所有种类的RNA分子和上百种的蛋白质因子才能正常运转，这些分子组成了一个高效而精确的翻译机器。本章将主要介绍参与蛋白质生物合成的各种主要的生物大分子的结构和功能，原核和真核生物翻译的基本过程和机制。,蛋白质是生命的物质基础，在细胞的代谢中执行着至关重要的功能，比如酶、受体、离子通道等。绝大部分的生命活动是在蛋白质的参与下完成的，因此，,研究蛋白质的生物合成对于深入理解生命活动的规律，在分子水平探索控制生命活动和治疗疾病的途径，推进蛋白质组学的发展是十分重要的。,2,9.1 蛋白质生物合成的概述,在蛋白质生物合成的过程中，氨基酸先与tRNA结合形成氨酰-tRNA，然后在核糖体和mRNA的复合物上，将氨酰-tRNA上的氨基酸加入到多肽链中。核糖体结合到mRNA分子的起始序列上，从mRNA的,5,到3,阅读遗传密码，从蛋白质的,氨基端到羧基端,合成多肽链。在一个mRNA分子上可以结合多个不同时间开始翻译的核糖体，称多聚核糖体。在原核生物中，翻译的过程是与转录同步进行的，而在真核生物中，转录和翻译在时空上是彼此分开的，转录在细胞核中完成，而翻译是在细胞质中完成的。,3,9.1.1 mRNA是蛋白质合成的模板,在1956年,1961年期间，由Jacob等人领导的四个不同的实验室，通过用T4噬菌体感染大肠杆菌，发现了,指导蛋白质合成的直接模板是mRNA,。蛋白质体外合成实验，进一步证明了mRNA是蛋白质合成的模板。,mRNA是作为中间物质传递DNA分子上遗传信息的。它具有以下特点，其碱基组成与相应的DNA的碱基组成一致； mRNA链的长度不一，这样它所编码的多肽链长度是不同的； 在肽链合成时mRNA与核糖体结合； mRNA的半衰期很短，代谢速度快。,4,原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一细胞空间内，而且这两个过程几乎同时进行，蛋白质的生物合成一般在mRNA刚开始转录时就开始了。,原核细胞,的mRNA半衰期非常短， mRNA的降解紧跟着蛋白质的翻译过程，一般认为是,2min左右,。,真核生物,就很不一样了，其mRNA通常会有一个前体RNA出现在核内，只有成熟的、经过化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。所以，真核生物mRNA的合成和蛋白质合成发生在细胞不同的时空中，mRNA半衰期也相对较长，大约是,1到24小时,之间。,5,mRNA作为翻译的模板，至少含有一个由起始密码子开始、以终止密码子结束的一段由连续的核苷酸序列构成的,开放阅读框,（open reading frame, ORF）。原核生物的起始密码子常为AUG，有时是GUG或UUG，而真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。mRNA的5,-,端和,3,-,端通常含有一段,非编码序列,（non-coding sequence, NCS）或,非翻译区,（untranslated region, UTR）。mRNA一般包括3个部分：编码区、位于AUG之前的5,-端,上游非编码区、位于终止密码子之后的3,-端下游非编码区。,ORF的5,-端有,核糖体结合位点,（ribosome binding site, RBS）。RBS含有富含嘌呤的,SD,（Shine-Dalgarno）,序列,，能被核糖体结合并开始翻译。每一个ORF的上游一般都有SD序列，每一个ORF编码一个多肽或蛋白质。原核生物的mRNA（包括病毒）一般为,多顺反子mRNA,（polycistronic mRNA），可以编码几个多肽。多顺反子mRNA是一组相邻或相互重叠基因的转录产物，这样的一组基因称为一个,操纵子,（见第11章）。,一旦,mRNA的5,-端,被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始会受到上游顺反子结构的调控,（图9-1）,。,真核细胞的mRNA为,单顺反子mRNA,（monocistronic mRNA），只能编码一个多肽。,6,7,9.1.2 tRNA是氨基酸的运载体,Crick经过比较核酸和氨基酸的大小和形状，认为它们不可能在空间上互补，因此预测可能存在一类分子,转换器,，使遗传信息从核酸序列转换成氨基酸序列。这种分子必须与模板形成氢键(即配对)， 很可能是核酸。1963年，Ehrenstein等人用实验证明了Hoagland在蛋白质生物合成中发现的，起介导作用的可溶性RNA分子就是Crick预言的分子转换器，,即tRNA,。tRNA携带特定的氨基酸，通过其反密码子环上的反密码子去阅读mRNA上的密码子，而其3,-末端恰好将所运转的氨基酸送到正在延伸的多肽上。一般书写时，将所运氨基酸写在tRNA的右上角，如tRNA,Phe,及tRNA,Ser,分别表示转运苯丙氨酸（Phe）和丝氨酸（Ser）的tRNA。 tRNA分子上与多肽合成有关的,功能位点至少有四个,，分别为3,-端CCA上的氨基酸接受位点、识别氨酰-tRNA合成酶的位点、核糖体识别位点及反密码子位点。,8,一个细胞内一般含有80多种不同的tRNA，负责运载20种氨基酸，这就意味着多数氨基酸可以有几种不同的tRNA。携带同一种氨基酸的几种不同的tRNA被称为,同工受体tRNA,。通过对tRNA结构与功能的关系研究证明，决定氨基酸专一性的主要因素是tRNA分子上的、由几个核苷酸甚至单个核苷酸组成的正、负元件，正元件决定一种tRNA接受哪一种氨基酸，负元件则决定tRNA不能接受何种氨基酸。一般来说，这些元件经常出现在氨基酸受体臂和反密码子环上，比如大肠杆菌中tRNA受体茎中的G3:U70碱基对就是这样的元件，它决定了这种tRNA能否运载丙氨酸；而能否运载缬氨酸则是由tRNA上的反密码子来决定了。,9,有一种特殊的tRNA值得关注，这就是,起始tRNA,（initiator tRNA），它的功能是识别起始密码子，参与翻译起始。在真核细胞中，起始tRNA携带甲硫氨酸，而在原核细胞内，它则携带甲酰甲硫氨酸。原核细胞内的这种起始tRNA分子结构上与其它tRNA分子有些不同，比如受体茎上第一对碱基不配对，反密码子茎上连续出现三个GC碱基对。突变实验证明，这些结构上的差别影响其参与翻译起始的部分功能。同时，这种tRNA携带Met以后，可以被特殊的甲酰化酶识别、催化，形成携带甲酰甲硫氨酸的tRNA。这样的tRNA只有在核糖体的肽酰tRNA结合部位才能启动翻译，确保它不去解码内部的Met密码子。,10,9.1.3 核糖体是蛋白质合成的场所,在蛋白质生物合成的过程中，,核糖体,(ribosome）就像是一个生产蛋白质的,机器,。核糖体是由几种核糖体rRNA和核糖体蛋白组成的亚细胞颗粒，位于细胞质内。一类核糖体附着于,粗面内质网,，参与,分泌性蛋白质合成,，另一类,游离于胞浆,，参与,细胞固有蛋白质合成,。在一个生长旺盛的细菌中大约有2000个核糖体，在真核细胞中更高达10,6,个，线粒体、叶绿体及细胞核内也有其自身的核糖体。在核糖体中的蛋白质占到了细胞总蛋白质的10%，其中的RNA占到了细胞总RNA的80%。,核糖体有大、小两个亚基，大亚基约为小亚基相对分子质量的一倍。每个亚基包含一个主要的rRNA成分和许多不同功能的蛋白质分子。大亚基中除了主要的rRNA以外，还有一些含量较小的RNA。虽然核糖体亚基中的主要rRNA基因的拷贝数很多，但是序列却相当保守，这说明rRNA在组成功能核糖体时起着重要的作用。,11,原核生物70S的核糖体中，50S大亚基由23S、5S rRNA各一分子和约30种蛋白质构成。30S小亚基由16S rRNA和约20种蛋白质构成。核糖体RNA暴露在亚基表面。真核生物80S的核糖体中60S大亚基由28S、5.8S和5S rRNA以及大约40种蛋白质组成，其中5.8S,rRNA,相当于原核生物23S rRNA 5,-端约160 nt，40S小亚基由18S rRNA和约30种蛋白构成（图9-2）。,12,23S rRNA有2904个核苷酸，有一段序列能与tRNA,Met,序列互补，表明23S rRNA可能,与tRNA,Met,的结合,有关。同时，在23S rRNA的5,-端有一段序列与,5S rRNA,的一部分序列互补，说明这两种RNA之间可能存在相互作用。,16S rRNA含有1475,1544个核苷酸，其3,-端一段ACCUCCUUA的保守序列，与,mRNA 的SD序列互补,，还有一段与,23S rRNA互补,的序列，参与30S和50S亚基的结合。,5.8S rRNA,是真核生物核糖体大亚基特有的rRNA，长度为160个核苷酸，它的一段CGAAC序列与原核生物,5S rRNA,中序列一样，表明它们可能具有相同的功能。此外，真核生物的,18S rRNA,可能与原核生物的,16S rRNA同源,。,5S rRNA含有120个核苷酸，保守序列CGAAC与tRNA分子的GTCG序列互补，保守序列GCGCCGAAUGGUAGU，与23S rRNA中的一段序列互补，是5S rRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点。,13,结构学家经过30多年的努力，利用电子显微镜术、免疫学方法、中子衍射技术、双功能试剂交联法、不同染料间单态-单态能量转移测定、活性核糖体颗粒重建等方法完成了对,E.coli,核糖体52种蛋白质氨基酸序列及三种rRNA空间结构的测定。大肠杆菌核糖体的30S,小亚基,大小为5.52222nm，分为,头、颈、体,，并有1,2个突起称为,平台,。50S,大亚基,大小为11.52323nm，rRNA主要定位于核糖体中央，蛋白质在颗粒外围。大亚基由,半球形主体和三个突起,组成，中间突起是5S rRNA结合之处，两侧突起分别称为柄 (stalk)和脊 (ridge)。30S和50S形成的70S核糖体直径约22nm，小亚基斜着以45角在50S亚基的肩和中心突之间。,不同生物体内的核糖体大小有别，但是其结构和功能是相同的。在多肽合成过程中，tRNA将相应的氨基酸带到核糖体，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择与遗传信息专一的AA-tRNA。核糖体还必须能同时容纳另一种携带肽链的tRNA，并使其能处于肽键易于生成的位置上。,14,核糖体的功能部位主要包括：,mRNA结合部位,，位于大小亚基的结合面上。 氨酰tRNA结合位点（aminoacyl-tRNA site），即,A位点,，其大部分位于大亚基而小部分位于小亚基，是结合或接受氨基tRNA的部位，也称为受体位点（acceptor site, A site）。 肽酰tRNA结合部位（peptidyl-tRNA site），即,P位点,，又称给位（donor site）。它大部分位于小亚基，小部分位于大亚基。 出位（exit site），即,E位点,，即空载tRNA在离开核糖体之前与核糖体临时结合的部位。,肽酰转移酶,（peptidyl transferase）活性位点，即形成肽键的部位（转肽酶中心）。 多肽链离开的,通道,。此外，还有负责肽链延伸的,各种延伸因子的结合部位,（图9-3）。,15,16,核糖体的小亚基负责对mRNA进行特异性识别，如起始部位的识别、密码子和反密码子的相互作用等。大亚基负责AA-tRNA、肽基-tRNA的结合和肽键的形成等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。新生的肽链必须通过离开通道离开核糖体。一般来说，通过核糖体移动，一个tRNA分子可从A部位到P部位到E部位。,核糖体是由几种rRNA和多种蛋白质组成的超分子复合物，rRNA和蛋白质先自组装成大小两个亚基，再由两个亚基结合成一个完整的核糖体。这种组合是可逆的，在翻译的起始阶段，亚基是需要解离的，随后再结合成70S/80S颗粒，开始翻译过程。,17,9.1.4 参与蛋白质合成的各种辅因子,蛋白质合成的起始、延伸和终止过程各自都要有蛋白因子的协助。,在原核生物中参与翻译的蛋白因子，主要有,起始因子,（initiation factors, IF）如IF1、IF2和IF3，,延伸因子,（elongation factor, EF）如EF-Tu、EF-Ts和EF-G，参与多肽链释放的,释放因子,（release factor, RF）如RF1、RF2和RF3，还有促进核糖体循环的,核糖体循环因子,（ribosome recycling factor, RRF）。其中的某些蛋白质因子属于能够与鸟苷酸结合的,小分子G蛋白,（表9-1）。,真核生物的起始因子（eukaryote initiation factor, eIF）为数较多，有些有亚基结构，目前已发现的真核起始因子有12种左右，各有其功能。延伸因子为EF1、EF2和EF3，释放因子有eRF1和eRF3。这些蛋白因子在蛋白质合成的过程中各自的作用，将在介绍翻译过程时进行更加详细的解读。,18,辅因子,功能,IF1,无专门功能，辅助IF-2和IF3的作用,IF2（GTP）,是一种小分子G蛋白，与GTP结合，促进fMet-tRNA,fMet,与核糖体30S小亚基结合,IF3,促进核糖体亚基解离和mRNA的结合,EF-Tu （GTP）,是一种小分子G蛋白，与GTP结合的形式促进氨酰-tRNA进入A部位,EF-Ts,是鸟苷酸交换因子，使EF-Tu、GTP再生，参与肽链延伸,EF-G（GTP）,是一种小分子G蛋白，使肽链-tRNA从A位点转移到P位点,RF1,识别终止密码子UAA或UAG,RF2,识别终止密码子UAA或UGA,RF3（GTP）,是一种小分子G蛋白，与GTP结合，RF1和RF2的活性,RRF,翻译终止后促进核糖体解体的作用,表9-1 原核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子,19,9.2 遗传密码的破译,在20世纪中期，人们认识到了DNA是携带遗传信息的分子，并通过RNA控制蛋白质的合成。但是这个控制过程是如何实现的呢？也就是说核酸分子中的核苷酸序列是如何指导蛋白质分子中的氨基酸顺序的呢？我们把这种DNA上的核苷酸与蛋白链上特定的氨基酸的对应关系称为,遗传密码,（genetic code）。现在我们大家都知道，密码子是指mRNA链上三个连续的核苷酸决定一个特定的氨基酸。,遗传密码的破译是20世纪生物学最辉煌的成就之一,，了解这一过程，有助于提高科学思维的能力。,20,9.2.1 遗传密码是三联体,遗传密码是mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序，即mRNA上核苷酸与蛋白质中的氨基酸的对应关系。那么它们是如何对应的呢？,首先进行的是简单的数学推理，mRNA只有四种核苷酸，而蛋白质有20种常见氨基酸，如果每一个核苷酸为一个氨基酸编码，只能决定四种氨基酸，如果每二个核苷酸为一个氨基酸编码，可决定16种氨基酸(4,2,= 16)，这两种编码方式显然不能满足需要。如果三个核苷酸为一个氨基酸编码，可构成64种密码 (4,3,= 64)，若四个核苷酸编码一个氨基酸，可构成256种密码 (4,4,= 256)。可见，3个核苷酸决定1种氨基酸，构成为,三联体密码,（triplet codon），既可满足为20种氨基酸的编码，又符合生物体在亿万年进化过程中形成的遵循简单的原则，是可能性最大的编码方式，随后的遗传突变实验证明了上述推理是正确的。,21,Crick等人研究了T4噬菌体的两个基因的变异，这两个基因与噬菌体能否感染大肠杆菌有关。用可以,诱导核苷酸插入或丢失的吖啶类试剂处理T4噬菌体II位点上的两个基因，在上述位点通过插入或缺失核苷酸后产生突变体，以及两个缺失型突变体或两个插入型突变体重组得到的重组体，都是严重缺陷型的，不能感染大肠杆菌。从一个,缺失型突变体,或,一个插入型突变体,重组得到的重组体，却能够恢复感染活性。如果在非常靠近的位置缺失或插入三个核苷酸，其突变体也表现出正常的功能，若缺失或插入四个核苷酸，即使彼此非常靠近，突变体也是严重缺陷的。说明,遗传密码是连续的，非重叠的三联体,。如果在编码序列上的任意位置插入或者删除一个核苷酸都会改变其阅读框，从而发生移码突变而使基因失活。但如果插入或者删除三个核苷酸，或者插入一个核苷酸又删除另一个核苷酸，在变异位点之后仍然可以恢复正常的阅读框，可读框的变化较小，这是基因与蛋白质共线性（colinearity）关系的最早证据（图9-4）。,22,23,此外，比对蛋白质的氨基酸数目和它的mRNA的核苷酸数目，也可证明遗传密码是三联体。早期有人研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的mRNA片段长1200个核苷酸，与三联子密码体系正好相吻合。但是需要提到的是，这种方法在很多情况下并不准确，因为许多蛋白质在翻译以后经过复杂的加工，会丢掉一些氨基酸序列。,在Crick等提出遗传信息在核酸分子上以非重叠、无标点、三联体的方式编码之后，最富挑战性的工作就是搞清楚三联体密码与氨基酸之间的对应关系。,24,9.2.2 用人工合成的多聚核苷酸破译遗传密码,从1961年到1966年，遗传密码的破译差不多用了6年的时间，Ochoa和Khorana发明了,人工合成多聚核苷酸,的技术，这样就可以得到特定序列的RNA作为实验时的翻译模板。Nirenberg等建立,了无细胞翻译系统,(cell-free translation system)，为使用人工合成的RNA模板进行翻译提供了基本的实验条件。,Ochoa发现核苷二磷酸(NDP)在多核苷酸磷酸化酶的作用下，在体外就可以聚合成多聚核苷酸。通过控制NDP的种类和比例，可得到同聚物与异聚物两类多聚核苷酸。,同聚物,就是仅由一种核苷酸组成，里面只有一种密码子，比如polyU(密码子是UUU)，polyA(密码子是AAA)。,异聚物核苷酸,是由两种以上的核苷酸组成，含有多种密码子。例如，以A和C原料合成的polyAC可能含有8种不同的密码子：CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。各种密码子占的比例由A和C的比例决定，例如当C和A的比例等于5:1时，CCC出现的几率最高为(5/6),3,= 57.9%，CCA、CAC、ACC出现的比例为(1/6)(5/6),2,= 11.6%，CAA、ACA、AAC出现的几率为(1/6),2,(5/6) = 2.3%，AAA出现的几率最低，为(1/6),3,= 0.4%,25,Note: Presented here is a summary of data from one of the early experiments designed to elucidate the genetic code. A synthetic RNA containing only A and C residues in a 5:1 ratio directed polypeptide synthesis, and both the identity and the quantity of incorporated amino acids were determined. Based on the relative abundance of A and C residues in the synthetic RNA, and assigning the codon AAA (the most likely codon) a frequency of 100, there should be three different codons of composition A,2,C, each at a relative frequency of 20; three of composition AC,2, each at a relative frequency of 4.0; and CCC at a relative frequency of 0.8. The CCC assignment was based on information derived from prior studies with poly(C). Where two tentative codon assignments are made, both are proposed to code for the same amino acid.,*These designations of nucleotide composition contain no information on nucleotide sequence (except, of course, AAA and CCC).,1250.8,250.8,50.8,26,实验显示AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成，根据共聚物中不同三联体碱基组成的比例，和翻译产物中氨基酸比例的对应关系，确定了Asp、Glu和Thr的密码子含2A和lC；His的密码子含1A和2C；Thr的密码子也可以含1A和2C；Pro为3C或1A和2C；Lys为3A。但上述方法只能显示密码子中碱基组成，而,不能确定A和C的排列次序,。例如，Asp，Glu和Thr的2A和1C可能有三种排列方式，即AAC、ACA、CAA。此外，反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时，用上述方法在破译更为复杂的密码子比如ACG时，就很困难了。,27,Khorana发明了化学合成法，利用有机合成可以得到一系列有序的多聚核苷酸，比如UCUCUCUC，以及仅由三个核苷酸组成的三聚核苷酸，比如CUG。,Nirenberg等人建立了,E.coli,无细胞翻译系统，也就是保留翻译能力的活细胞提取物，一般是由翻译活性高、分裂旺盛的活细胞制备而成。Nirenberg利用该系统研究了病毒蛋白质的合成。他们应用烟草花叶病毒的基因组RNA为实验模板，利用polyU作对照模板。但令人意想不到地发现了，polyU作为对照模板，指导了一种氨基酸的参入，得到了多聚苯丙氨酸。也就是说，三联体遗传密码UUU被破译了，它指导编码Phe。从此，展开了遗传密码的破译工作。利用同样的方法他们又破译了AAA编码Lys，CCC编码Pro。,使用一些有序的多聚核苷酸作为模板，能破译一些遗传密码。比如多聚二核苷酸5UGU GUG UGU GUG UGU GUG3，不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。以其作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽。,28,9.2.3 用人工合成的三核苷酸破译遗传密码,用Khorana发明的化学合成法，可以得到仅由三个核苷酸组成的三聚核苷酸。随后，Leder和Nirenberg发明了,核糖体结合技术,，其要点是：以人工合成的三核苷酸为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后，通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合核糖体与未结合核糖体的AA-tRNA分开。当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体能够与特异性氨酰-tRNA相结合。通过鉴定结合在硝酸纤维素滤膜上的氨酰-tRNA氨基酸的性质，就可以确定原来的三聚核苷酸决定哪一种氨基酸，进而弄清楚一种氨基酸的密码子。使用这项技术，最终破译了20种氨基酸所对应的61个三联体密码。另外3个为终止密码，是用遗传学方法破译的。,29,30,31,由于Nirenberg和Khorana在遗传密码破译方面所做出的贡献，他们同测出酵母Ala-tRNA一级结构的Holley分享了1968年的诺贝尔生理学或医学奖。,32,9.3 遗传密码的特性,9.3.1 遗传密码是连续排列的三联体,mRNA中的4种碱基组成的密码子代表了20种氨基酸，同时决定了翻译过程的起始与终止位置。每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸，两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以分离，即遗传密码是,连续排列的三联体,。其基本单位是按照53方向编码、不重叠、无标点的三联体密码子。AUG为甲硫氨酸兼起始密码子。终止密码子是UAA、UAG及UGA。要正确阅读密码，必须从起始密码子开始，按照可读框连续读下去，直到遇到终止密码子。如插入或者删除一个核苷酸，就会使得以后的读码发生错位，发生移码突变（frame-shift mutation）。mRNA从5-端到3-端的核苷酸排列顺序就决定了多肽链中从N端到C端的氨基酸排列顺序。,研究证明，在绝大多数生物中，基因是不重叠的，即使在重叠基因中，各自的可读框仍按三联体方式连续读码。,33,9.3.2 起始密码与终止密码,绝大多数生物体以,AUG为起始密码子,，同时,也是Met的密码子,。在原核细胞中，AUG有两个tRNA：起始tRNA，即Met-tRNA,i,Met,与起始因子IF2作用形成30S复合物。中间tRNA即Met-tRNA,Met,与延长因子EF-Tu作用，使Met进入mRNA的内部AUG。少数细菌用GUG做起始码（在起始位点编码fMet，在密码表中编码Val）。在,E. coli,中GUG起始频率为AUG的1/30。真核生物偶尔用CUG作起始Met的起始密码子，有时也以UUG、AUU为起始密码子，但使用频率更低。,UAA，UAG，UGA是终止密码，不代表任何氨基酸，也称无意义密码子。,UAA,为褐石型密码子（ochre codon），,UAG,为琥珀型密码子（amber codon）；,UGA,为蛋白石型密码子（opal codon）。UAA终止效率最高，UGA次之，UAG最低。原核细胞的RF1识别UAA、UAG；RF2识别UAA、UGA。UAG容易被读通，有的基因有时连用2个、甚至3个终止密码子以强化终止，保证翻译到此终止，不致产生超长蛋白质。,34,9.3.3 遗传密码的简并性,遗传密码的,简并性,(degeneracy)是指一种氨基酸有几个密码子的现象。除Trp和Met只有1个密码子外，其它氨基酸均有1个以上的密码子，对应于同一种氨基酸的不同密码子称为,同义密码子,（synonymous codon）。,简并性具有重要的生物学意义，它可以减少有害突变。如每种氨基酸只有一个密码子，61个氨基酸中只有20个是有意义的，各对应一种氨基酸，剩下的密码子无氨基酸对应。当读到这里时会使肽链合成终止。由基因突变而引起肽链合成终止的概率也会大大提高。简并性使得即使密码子中碱基有变化，仍然能编码原来氨基酸的概率会大大提高。密码的简并性也使得DNA分子上碱基组成有较大余地的变动。比如，细菌DNA中G + C含量变动较大，但不同G + C含量的细菌却可以编码出相同的多肽链。所以简并性在物种的稳定性上起着重要的作用。,35,简并性除了能降低突变所造成的损害外，还可减少所需的tRNA种类。密码子共有64种，但并不需64种tRNA。密码子的专一性主要由前两个碱基决定，而后一个碱基的作用有限，这对保证物种稳定性有一定意义，并可以减少突变的发生。但并不是所有的简并性都是前两个核苷酸相同，如有6个密码子的Leu、Arg、Ser的前两个核苷酸并不全都相同。,36,氨基酸的密码子数目与该氨基酸残基在蛋白质中的使用频率有关，越是常见的氨基酸其密码子越多，但它们之间并无严格的对应关系。由于遗传密码是在生命起源的早期形成的，所以即使密码子数目与其在蛋白质中的使用频率有关，也应该对应于原始蛋白质中氨基酸的出现频率。,37,9.3.4 遗传密码的变偶性,如前所述，遗传密码的简并性主要表现在,第三位碱基,上，如甘氨酸的密码子是GGU、GGC、GGA、GGG，丙氨酸的密码子是GCU、GCC、GCA、GCG。前两位碱基相同，只是第三位不同。甚至有的氨基酸只有两个密码子，一般第三个碱基或者是嘧啶，或者是嘌呤。例如，天冬氨酸的密码子GAU、GAC，第三位皆是嘧啶。显然，遗传密码的专一性主要取决于前两位的碱基。密码子的第三位碱基具有较大的灵活性。与此对应的，反密码子的第一位碱基与密码子的第三位碱基的配对可以在一定范围内变动。即密码子和反密码子的配对具有摆动性，称为,遗传密码的变偶性,（wobble）。也就是说，mRNA上的密码子的第1、2个碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对，密码的专一性，主要是由于这两个碱基对的作用。而由于tRNA三维结构的影响，反密码子的5-端碱基在与密码子3-端碱基配对时，产生了一定范围的摆动，虽然第3碱基的配对可以有一定灵活性，但不是任意组合。,38,39,反密码子的第1个碱基（以53方向，与密码子的第3个碱基配对)决定1个tRNA所能解读的密码子数目。反密码子的第1个碱基是C或A时，只能和1个密码子结合。反密码子的第1个碱基是U或G时，可和两个密码子结合，即U可和A或G配对，G可和C或U配对。反密码子的第1个碱基是I时，可和3个密码子结合，即I可和A、U或C配对（表9-3）。,从已知结构的tRNA中发现其反密码子第一位碱基为C、G、U、I，没有A，显然I由A转变而来。变偶性的意义在于，当第三位碱基发生突变时，仍然能翻译出正确的氨基酸，使合成的多肽具有生物学活性。因此变偶性又可认为是，反密码子的5-端碱基与密码子的3-端碱基的非正规配对，而使正确的氨基酸进入非正确的密码子的现象（图9-5）。,tRNA反密码子的第一位碱基,I,U,G,A,C,mRNA密码子的第三位碱基,U，C，A,A，G,U，C,U,G,表9-4 密码子和反密码子配对的变偶性,40,9.3.5 遗传密码的通用性,密码子的通用性，是指各种低等和高等生物，包括病毒、细菌以及真核生物，基本共用一套遗传密码。这可以通过交叉试验证明，比如将兔的网织红细胞的多聚核糖体与大肠杆菌的氨酰-tRNA以及其它蛋白质合成因子一起进行反应，结果合成的是兔血红蛋白，这充分说明大肠杆菌tRNA上的反密码子可以很正确地阅读兔血红蛋白mRNA的编码序列。再比如前面提到的无细胞体系中，烟草花叶病毒RNA可以在大肠杆菌的无细胞体系中合成病毒外壳蛋白。随后的实验也证明细菌的基因能在人的细胞中正确表达，表明了原核和真核生物的遗传密码是通用的。近三十年来，随着基因和蛋白质测序技术的发展，也充分证明了,生物界有一套共同的遗传密码,。,但是,线粒体DNA,（mtDNA）的编码方式与通用遗传密码,有所不同,。,41,表9-5 线粒体中变异的遗传密码,* N 为任意碱基,42,表9-6 特殊的遗传密码,除了线粒体以外，某些生物的细胞基因组密码也出现了一定的变异。如通常意义的终止密码子UGA在支原体中编码Trp等等（,表9-,6）。,43,9.3.6 遗传密码的防错系统,遗传密码进化方式是以突变影响的最小化来进行的，比如最常见的突变是转换，很少见颠换，遗传密码的,第三位转换通常不改变其编码的氨基酸,。,颠换,如果发生在第三位，有,一半是无效,的，,另一半将导致相似氨基酸的互换,，如天冬氨酸（GAU，GAC）或谷氨酸间（GAA，GAG）的互换。如果,第二位发生转换,的话，会导致化学性质,相似氨基酸间的转变,，但如果,颠换,的话，就会,改变氨基酸的类型,。,密码子的碱基顺序与其对应氨基酸理化性质之间存在一定关系，尤其是第二位碱基影响最大。,第二个碱基为U时,，常,编码非极性、疏水和支链氨基酸,。第二个碱基为,A或G,时，常编码,亲水性的氨基酸,。当第一个碱基为C或A，第二个碱基为A或G，第三个碱基无特异性时，所决定的氨基酸具有可解离的,亲水性侧链并具有碱性,。带有,酸性亲水侧链,的氨基酸密码子前两位为AG，第三位为任意碱基。 大部分同类氨基酸密码子含2个相同的核苷酸，如Ser和Thr理化性质很接近，其密码子分别是UCN和ACN。若Ser的第1个核苷酸U突变成A，就变成Thr，这对蛋白质的结构和功能影响不大。若Ser的第3个核苷酸突变成其他核苷酸，则仍是Ser。,可见，密码子的一个碱基被置换，多数情况下仍编码相同的氨基酸，或性质最接近的氨基酸。这种机制将把突变可能造成的危害降至最低，也就是我们所说的编码具有防错功能，是进化中获得的最佳选择。,44,9.3.7 可读框,可读框,（open reading frame, ORF）是指从起始密码子起到终止密码子的一段连续的密码子区域，或者在DNA测序时，由计算机辨认出的可能的编码区域。比如基因组测序的结果中，都可以辨认出的始于ATG，止于TGA、TAA、TAG的连续的密码子区域。这种可读框如果没有已知的蛋白质产物，就被称为可读框，如果能够编码已知的蛋白质就被称为编码区。所以，可读框就是潜在的编码区。,另外，还有一种重叠基因的情况，也就是一个基因的编码区部分或者全部与另一个基因的编码区重叠，这样一种可读框编码一种蛋白质，而其他可能的可读框编码第二种蛋白质的一部分或全部。某些较小病毒的基因组利用这种方式来增加它们基因组的编码能力，但这也就引出一个问题，在原核生物中，核糖体为了翻译重叠基因，必须能够发现第二个起始密码子，这一步可在不解离模板的状态下进行。而真核生物则采取不同的方式起始蛋白质合成，通常采取可变RNA加工方式来从一个基因合成不同的蛋白质。,45,9.4 氨酰-tRNA的合成,9.4.1 合成氨酰-tRNA的反应,在蛋白质的生物合成的过程中，只有与tRNA相结合的氨基酸才能被准确运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。,氨基酸在进行合成多肽链之前必须先经过,活化,，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程依靠,氨酰-tRNA合成酶,（aminoacyl-tRNA synthetase，aaRS）催化，此酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨酰-tRNA，反应消耗ATP生成AMP和焦磷酸，焦磷酸很快被分解，推动氨酰tRNA的生成（图9-6a）。氨酰tRNA合成酶分为两类，,I型,氨酰-tRNA合成酶和,II型,氨酰-tRNA合成酶各自负责合成10种氨酰-tRNA（表9-6）。,类型I,Arg, Cys, Gln, Glu, Ile, Leu, Met, Trp, Tyr, Val,类型II,Ala, Asn, Asp, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr,表9-7,两类tRNA合成酶负责的氨基酸,46,如图9-6b所示，合成氨酰-tRNA的反应是分两步来完成的。第一步氨基酸在氨酰-tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，形成氨酰-AMP，再与氨酰-tRNA合成酶结合形成三联复合物。第二步该复合物再与特异的tRNA作用，将氨酰基转移到tRNA的3-末端腺苷残基的2-羟基（I型酶）或3-羟基（I型酶）上（图9-6c）。,47,I型酶是单体酶，与反密码子臂和氨基酸臂的小沟一侧结合，将氨基酸臂置于酶的活性部位，将氨基酸加在tRNA分子末端核糖的2-羟基上，随后通过酯交换将氨基酸转移到3-羟基上。,II型酶一般是同源二聚体，与tRNA分子反密码子臂和氨基酸臂的大沟一侧结合，将氨基酸加到tRNA末端核糖的3,-羟基上（图9-7）。由于这两类氨酰-tRNA合成酶序列和三维结构完全不同，所以它们在进化上很有可能是独立的。,48,翻译开始的第一个氨基酸是甲硫氨酸，同时，甲硫氨酸也可以出现在台联的中间。所以体内存在两种Met-tRNA，其中一种是Met-tRNAi,Met,，它与核糖体小亚基结合，起始肽链合成。另一种Met-tRNA,Met,，只能将Met掺入到到蛋白质内部。对这两种Met-tRNA,Met,的识别由参与蛋白质合成的起始和延伸因子决定，起始因子识别tRNAi,Met,，延伸因子识别tRNA,Met,。这两种Met-tRNA既能被唯一的甲硫氨酰-tRNA,Met,合成酶识别，又能被蛋白质合成的因子所区分，不会被混淆。,在细菌中，起始氨基酸被活化以后还要被特异的甲酰化酶甲酰化，甲酰基的供体是N,10,-甲酰四氢叶酸。,N,10,-甲酰四氢叶酸+ Met-tRNA,fMet,四氢叶酸+ fMet-tRNA,fMet,真核生物多肽合成都是从生成甲硫氨酰-tRNAi,Met,开始的，细菌中存在的甲酰化情况在进化过程中消失了。,49,9.4.2 氨酰-tRNA合成酶的特异性,氨酰-tRNA合成酶存在于细胞浆中，分为单体（,1,）、二聚体（2）和同型或异型四聚体（4或22）等，其多肽链的长度从344个氨基酸到1000个不等。真核氨酰-tRNA合成酶可形成11条肽链组成的特殊聚集体，Mr为 1000kD。氨酰-tRNA合成酶上有氨基酸结合位点、tRNA结合位点和ATP结合位点。tRNA的结合位点在tRNA空间构象L形的侧面，氨酰-tRNA合成酶能够,区分细胞中的40多种形状相似，但并不完全同的tRNA分子，这主要依赖于tRNA分子上的,鉴别元件,。有些tRNA的鉴别元件为反密码子，如,tRNAi,Met,，另一些tRNA的鉴别元件在其它部位，比如tRNA,Ala,氨基酸臂上的鉴别元件G3-U70碱基对，如果用它来替换tRNA,Phe,的G3-C70，丙氨酰-tRNA合成酶会将丙氨酸连接到tRNA,Phe,。tRNA的鉴别元件也通常被称为是RNA的个性（identity），也有人称之为,第二套遗传密码,（图9-8）,。,50,51,在合成肽链时，,mRNA只能识别特异的tRNA,而不是氨基酸。,14,C标记的半胱氨酸与tRNA,Cys,结合后生成,14,C-,Cys,-tRNA,Cys,，经镍催化可生成,14,C-Ala -tRNA,Cys,（图9-9），将其加进含血红蛋白mRNA的兔网织细胞蛋白质合成系统里，结果发现Ala 插入了血红蛋白分子通常由,Cys,占据的位置上，证明了,mRNA,识别的是tRNA而不是氨基酸。,52,同一种氨酰tRNA合成酶能够作用于运载同一种氨基酸的一组同功tRNA，故大多数细胞有二十种不同的氨酰-tRNA合成酶。不同的tRNA有不同的碱基组成和空间结构，容易被酶识别。绝大多数氨基酸之间也是有很大的不同，准确性也不难保证，比较困难的是识别结构上非常相似的氨基酸。氨酰-tRNA合成酶,既有高度的特异性,，又有,严格的校对,（editing）功能。如异亮氨酸的氨酰tRNA合成酶中，有一个能识别异亮氨酸的小洞，这个洞太小，而不适合像甲硫氨酸和苯丙氨酸这样的大分子进入，并且，这个洞是疏水的，带有极性侧链的氨基酸，也被阻挡在外。但是比异亮氨酸稍小的缬氨酸，由于仅比它少了一个甲基，刚好能进入这个口袋。缬氨酸代替异亮氨酸的几率为1/150，这个错误率就太高了。好在异亮氨酸的氨酰tRNA合成酶能够识别错误连接的缬氨酸，并用其水解酶活性切除缬氨酸，留下tRNA分子，等待正确的异亮氨酸，这个校正步骤可以将错误率降低至一万分之一。,53,9.5 原核生物的蛋白质合成,9.5.1 原核生物肽链合成的起始,在肽链合成的起始阶段，首先在mRNA上选择合适位置的起始密码AUG，使核糖体小亚基与mRNA结合。Shine和Dalgarno与 1970年代初发现，在细菌的mRNA上通常含有一段富含嘌呤的碱基序列，后来被称为,SD序列,（5-AGGAGGU-3）。该序列一般位于起始AUG序列上游10个碱基左右的区域，能与细菌16SrRNA 3-端的7个嘧啶碱基组成的,反SD序列,互相识别，以此帮助从AUG处开始翻译。这种特异识别已经被证实是细菌中蛋白质合成识别起始密码的主要机制。如果在SD序列上发生增强碱基配对的突变时，能够促进翻译起始，反之削弱碱基配对的突变将导致翻译起始效率的下降。表9-7列出了一些mRNA的SD序列和16SrRNA，mRNA的起始密码和SD序列的一致序列已用下划线标出。,54,16S rRNA,3,HO AUUCCUCCACUA 5,lacZ,mRNA,5,ACAC,AGGA,AACAGCU,AUG,3,trpA,mRNA,5,AG,GAGGGG,AAAUCUG,AUG,3,RNA 聚合酶mRNA,5,GAGCU,GAGG,AACCCU,AUG,3,蛋白L10 mRNA,5,C C,AGGA,GCAA AGCUA,AUG,3,表9-8 大肠杆菌16S rRNA与SD序列的识别,原核生物蛋白质合成的起始因子IF1、IF2、IF3在数目上均是核糖体的十分之一，其Mr分别为9kD、120kD和22kD。,IF3,的功能是促使核糖体的30S和50S亚基保持分开，,IF-1,的功能则是促进IF-3与小亚基的结合，加速大小亚基的解离。,IF-2,是一种小分子G蛋白，与GTP结合，促进fMet-tRNA,fMet,与核糖体30S小亚基结合。如图9-10所示，翻译起始被分为3个步骤。,55,（1） 形成mRNA-30S复合物 只要,SD序列与核糖体小亚基的16S rRNA的,反,SD,序列之间有三个以上的碱基配对，就会出现核糖体和,mRNA,的结合，从而形成,IF3-30S-mRNA,复合物,。原核生物的每个顺反子,mRNA,内部编码序列的,5,-,端都有起始密码子和核糖体结合位点，核糖体能够独立与其结合。但,SD,序列附近的二级结构对核糖体的结合、翻译效率有一定影响。游离的,30S亚基首先与,IF-1和IF-3结合，以阻止在mRNA结合前30S亚基与大亚基的结合，防止无活性核糖体的形成。,（2）,30S起始复合物与fMe-tRNA,fMet,结合,在,IF-2,及,GTP参与下,，,30S-mRNA,复合物进一步,与,fMet-tRNA,fMet,-GTP-IF-2,结合,。,三种,IF,一起存在，协同作用，是,fMet-tRNA,fMet,的最佳结合条件。在缺乏,GTP,及其他因子时，,IF-2,本身并不能结合到,30S,亚基上。,IF-2,是促进,fMet-tRNA,fMet,结合到,30S,复合物的主要因子。完整的,30S,起始复合物包括一个,30S,亚基、,mRNA,、,fMet-tRNA,fMet,、,GTP,、,IF-1,、,IF-2,、,IF-3,，同时要求,mRNA,的起始密码子,AUG,处于,P,位点。,这一反应中,只有,fMet-,tRNA,fMet,进入核糖体受,IF-2,的控制，结合,于,30S,亚基的,P,位点，解读起始密码子,AUG,。,其他,氨酰-,tRNA,，包括,Met-tRNA,Met,，不受,IF-2,控制，,只能进入,A,位点，阅读,mRNA,内部的密码子。,56,（,3,） 形成,70S,起始复合物 在,30S,复合物与,50S,大亚基结合之前，,IF-l,和,IF-3,相继从复合物中脱落下来，然后,GTP,水解成,GDP,和磷酸释能，,IF-2,离开复合物。,GTP,水解是驱动,IF-2,释放，否则,IF-2,干扰形成有活性的,70S,起始复合物。,IF-2,具有核糖体依赖性,GTPase,活性（,ribosome-dependent GTPase activity,），能水解,GTP,。,IF-2,和完整核糖体一起构成,GTPase,，,IF-2,本身不是,GTPase,，但可以激活某种核糖体蛋白。,GTP,水解使,IF-2,去偶联，而,fMet-tRNA,fMet,仍旧保持结合状态。,IF-2,解离使核糖体构象改变，从无活性复合物转变为有活性的,70S,起始复合物。在起始复合物中，核糖体,P,位被,fMet-tRNA,fMet,占据，而,A,位空着，有待于对应,mRNA,上第二个密码的相应氨酰,-tRNA,进入，从而进入延长阶段。,57,9.5.2,原核生物肽链的延伸,肽链的,延伸,（,elongation of polypeptide chain,）指后续的氨酰-tRNA进入核糖体，形成肽键的过程。延长过程所需的延伸因子(elengation factor, EF) 包括热稳定性的EF-Ts，热不稳定性的EF-Tu，和促使核糖体移位的,EF-G,，肽链的延伸分进位、转肽和移位三个步骤。,（1）进位,进位,(entrance)指氨酰-tRNA的反密码子与mRNA的密码子在核糖体识别，使氨酰-tRNA进入,核糖体的,A,位。起始复合物形成后，后续的氨酰,-tRNA,在延伸因子,EF-Tu,及,GTP,作用下，生成,AA-tRNAEF-TuGTP,复合物，然后进入核糖体的,A,位，进入的氨酰,-tRNA,的种类由,A,位的密码子决定。这时，,GTP,被水解释放，驱动从核糖体释放。若正确的氨酰-tRNA进入A位，,EF-Tu,的,GTP,酶活性很快被激活，将,GTP,水解为,GDP,和,Pi,，引起,EF-Tu,的构象变化，使,EF-Tu-GDP,脱离核糖体。随后，,EF-Tu-GDP,中的,GDP,被,EF-Ts,替代，然后,EF-Ts,又可被,GTP,替代，重新生成,EF-Tu-GTP,（图9-11）,。,58,（2）转肽,转肽,(transpeptidation)包括转位反应和肽键的形成,，这个过程是和延伸因子从核糖体上解离下来同时进行的。催化这一过程的酶称为肽酰基转移酶（,peptidyl transferase,），催化的本质是使一个酯键转变成一个肽键，,P,位上的,tRNA,携带的甲酰甲硫氨酰（或肽酰）基转移到,A,位上新进入的氨酰,-tRNA,，与其所携带的氨酰的氨基以肽键结合。具体过程就是氨酰,-tRNA,上氨基酸的氨基对肽酰,-tRNA,上酯键的羰基进行亲核攻击而成的（图9-12）。,分离嗜热细菌的,50S,亚基的,23S rRNA,，结果发现，完整的,50S,亚基或,23S rRNA,中都可以完成转肽反应，而氯霉素、,RNase,等可抑制转肽反应。因此认为,23S rRNA,在肽基转移酶活性中起主要作用，后来的突变试验进一步验证了这个结果。,59,后续编码的氨基酸是添加在延伸肽链的羧基上的，肽键生成后，原在,P,位的脱去fMet的tRNA,fMet,（或脱去肽酰的,tRNA,）从核糖体上脱落。,60,（,3,）移位,移位,(translocation)指肽酰-tRNA和mRNA相对于核糖体的移动,，这一过程需要移位因子,EF-G,，并需要,GTP,水解功能。移位时核糖体沿,mRNA,的5,3,方向移动一个密码子，结果肽酰,-tRNA,从,A,位进入,P,位，去肽酰,-tRNA,被挤入,E,位，,mRNA,上一个新的密码子则对应于,A,位。放射性同位素标记的实验证明，脱去酰基的,tRNA,并不立即从核糖体上解离下来，而是移到了核糖体与,tRNA,分子结合构象的一个凹槽，称为,E,位点。直到新的氨酰,-tRNA,结合到,A,位点时，,E,位点空载的,tRNA,才解离下来（图9-13）。,移位的机制还可以从核糖体的,构象,方面来解释，核糖体具有两种构象状态，移位前,A,位和,P,位对氨酰-,tRNA,和肽酰,-tRNA,有较高的亲和性，,E,位亲和性较低，空载的,tRNA,容易从亲和性较低的,E,点解离。移位后，,A,位空载，新的氨酰-tRNA进入,A,位并完成转肽后，