exp12根瘤菌质粒的快速检测‘

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十二,根瘤菌质粒的快速检测,1,根瘤菌质粒的快速检测,目的要求,实验材料,实验程序,思考题,2,目的要求,了解根瘤菌质粒的有关特性,学习并掌握根瘤菌质粒的快速检测方法,3,实验材料,PA,液体培养基：,蛋白胨,4g、MgSO,4,7H,2,O 5g、dH,2,O（,蒸馏水）1000mL、pH 6.87.0。,TY固体培养基： 胰蛋白胨5g、酵母粉3g、CaCl,2,6H,2,O 1.3g、dH,2,O 1000mL、pH7.0。,10,X,TBE,电泳缓冲液： Tris108g、H,3,BO,3,55g、EDTA 9.3g、dH,2,O 1000mL、pH 8.3。,Tris-,蔗糖溶液： 蔗糖25g、0.025mol L,-1,Tris-HCl（pH8.0）100mL、,高压灭菌后4,0,C,保存。,RNA酶缓冲液： Tris-HCl（ pH7.5）10m mol、NaCl 15 m mol、高压灭菌后4,0,C,保存。,4,实验材料,RNA,酶溶液：RNA酶（Ribonuclease A，Sigma公司产品）4mg、 RNA酶缓冲液10mL、分装于小管中，100,0,C,水浴中处理15min以灭活DNA酶，-20,0,C,保存。,溶菌酶溶液：溶菌酶（Lysoxyme，Sigma公司产品）100mg、灭菌双蒸水（d,2,H,2,o）5mL、,分装于小管中，每管50,L，-20,0,C,保存。,裂解液（临用前配制）： Tris-蔗糖1mL（用后归于4,0,C）、,溶菌酶溶液（20mg/mL）50,L、 RNA,酶溶液（400,g/,mL）50,L、,溴酚蓝指示剂12滴。,5,实验材料,溴酚蓝指示剂：溴酚蓝0.25g、蔗糖40g、 dH,2,O 100 mL、,配后存于4,0,C,备用。,10%SDS：SDS10g、 dH,2,O 100 mL。,SDS,琼脂糖凝胶：0.65%琼脂糖凝胶2mL、 10%SDS 0.35mL、1XTBE 1.15mL、溴酚蓝指示剂1滴。,溴化乙锭染色剂：溴化乙锭100mg、 dH,2,O 100 Ml。,避光保存，因溴化乙锭是诱变剂，配制时要带手套，避免与皮肤接触。,6,实验程序,琼脂糖凝胶的制备,根瘤菌质粒DNA的制备,电泳及观察,7,实验程序,（琼脂糖凝胶的制备）,用70%酒精擦洗电泳胶板、挡板、隔板及梳子。,用夹子将隔板及梳子夹住，平放在电泳胶板上。注意隔板及梳子的底端要齐，并且梳子的底部与胶板的间距约0.5mm，同时下好挡板。,配制0.65%的琼脂糖-TBE胶，在微波炉上熔化摇匀，冷却至65,0,C左右倒在胶板上。倒胶之前先用琼脂糖胶封住电泳胶板的四周，以免漏胶。,配制3.5mL的SDS琼脂糖凝胶，熔化后于65,0,C水浴中保存备用。,待凝胶完全冷却后，小心地取出隔板，再将SDS凝胶注满由隔板形成的凹槽。,待SDS胶冷却后，小心地拔出梳子，放入电泳槽中，准备点样。,8,实验程序,（根瘤菌质粒DNA的制备）,将待测的根瘤菌在TY固体培养基上活化。,将活化后的菌株接种于5mLPA液体培养基中，与 28,0,C振荡培养过夜，直至对数生长中期（菌数约为10,4,个/mL）,取1mL菌悬液至1.5mL的小离心管中离心，弃去上清液并用滤纸条尽量吸去多余的液体，置于冰上30min。,加入新鲜配制的裂解液约,50,L（视菌体多少而定），搅匀后用点样器点入点样槽内，一般每槽点样为2030,L。,9,实验程序,（电泳及观察）,接通电源，使点样槽位于负极，先20V低电压电泳30min，然后升高到100V电泳6h。电泳过程中应注意观察溴酚蓝指示剂的电泳位置及情况。,关闭电源，取出电泳胶板，将凝胶放在含0.5,g/mL溴化乙锭的染色剂中染1530min，再转入蒸馏水中脱色1530min。,将脱色后的凝胶放在暗室中的紫外透射仪上观察结果，并注意戴好防护面罩。,10,思 考 题,如何区分染色体DNA与质粒DNA？,正常情况下，实验应出现怎样的结果？,11,实验十二,结 束,12,