核酸提取原理及常见问题

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/10/21,#,核酸提取原理及常见问题,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取常见问题、,原因,分析及其对策,基因组,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,酚氯仿,法,试剂,盒法,DNA,提取的几种方法,CTAB,法,原理,CTAB,，,是一种阳离子去污剂,，,可破碎细胞壁和,细胞膜,，,并与核酸形成复合物。,在高盐溶液中,(,1.4,mol,/,L NaCl,),是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度,(,0.7,mol,/,L NaCl,),时,从溶液中沉淀,。通过,离心,可将,CT A B,核酸,复合物同蛋白质 、 中性,多,糖类物质分开,。,溶解,于高盐溶液中的,CTA,B,核酸,复合物,加入乙醇可使核酸沉淀,而,CT A B,则溶于乙醇,.,注：,CTAB,溶液在低于,15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于,15,。,CTAB,法,（植物,DNA,提取经典方法）,CTAB,提取缓冲液的经典配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,-,巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,2%(W/V),0.1%,（,V/V,）使用前加入,Tris-HCl,（,pH8.0,）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,（脱氧核糖,核蛋白）易于溶解。,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,细胞裂解后释放的植物次生代谢,产物和多酚,类化合物易于氧化,氧化的多酚结合,到,DNA,分子上而致,D N A,降解；,多糖,的性质与核酸类似，会与核酸一同沉淀下来，影响,植物核酸,纯度。,CTAB,提取缓冲液的改进配方,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH8.0,）,NaCl,CTAB,PVP,-,巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,3%(W/V),2-5%(W/V),1-5%,（,V/V,）使用前加入,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖,。,同时,向抽提液中加入还原剂,-,巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。,改良方法,1,改良方法,2,加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞，去除部分杂质，离心得到细胞核；,针对多糖组织，得到细胞核之后可加入,1,X,PBS,清洗,2-3,次，去除多糖；,后续使用,CTAB,裂解液裂解细胞核。,核酸分离缓冲液：,200mM Tris-HCl,50mM EDTA,250mM NaCl,2%PVP,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,SDS,法原理,SDS,法,SDS,是一种阴离子去垢剂，在高温（,55,65,）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐,(KAc,或,NH,4,Ac),浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的,DNA,。,组份,Tris-HCl,（,pH8.0,）,EDTA,（,pH 8.0,）,NaCl,SDS,终浓度,10 mM,20 mM,0.4M,2%,SDS,法,DNA,提取缓冲液,SDS,法操作简单,温和,也可提取到较,高分子,量,DNA,但所得产物含糖类杂质,较多,CTAB,法,的最大优点是能较好地去除糖类杂质,SDS,法,流程图,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,酚氯仿裂解法,苯酚抽,提原理：,使蛋白质变性，同时抑制了,DNase,的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与,DNA,联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。,酚的优点：,1.,有效变性蛋白质；,2.,抑制了,DNase,的,降解作用,酚的缺点,：,能溶解,10-15%,的,水。,最后,用氯仿抽提,：,克服酚的缺点；加速有机相与液相,分层；去除,核酸,溶 液,中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中,）,用酚氯仿抽提细胞基因组,DNA,时，通常要在酚,-,氯仿中加少许,异戊醇，减少,蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含,DNA,的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,用乙醇沉淀,DNA,时,，通常,要在溶液中加入单价的阳离子，如,NaCl,或,NaAc,，,Na+,中和,DNA,分子上的负电荷，减少,DNA,分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。,DNA,提取常见问题,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等,杂质,重新,沉淀,DNA,，让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,问题一：,DNA,样品不纯，抑制后续酶解和,PCR,反应。,原 因,对,策,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，,DNA,被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：,DNA,降解。,对,策,原 因,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,低温沉淀，延长沉淀时间,加辅助物，促进沉淀,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：,DNA,提取量少。,对,策,原 因,RNA,的提取,异硫氰酸胍,/,苯酚法（如,Trizol,法）,CTAB,法,试剂,盒法,RNA,提取,异硫氰酸胍,/,苯酚法,原理：,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净,RNA,。,Trizol,法适用于普通的植物组织、动物组织以及真菌和细菌等。,酚类化合物被氧化后会与,RNA,不可逆地结合，导致,RNA,活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时,RNA,的丢失，或形成不溶性复合物；,而多糖会形成难溶的胶状物，与,RNA,共沉淀下来；萜类化合物和,RNase,会分别造成,RNA,的化学降解和酶解。,针对多糖多酚植物，可以采用,CTAB,法和,Trizol,法结合的方法，针对性的去除多糖多酚。,对于富含色素、蛋白和多糖的藻类，可采取试剂盒方法。,组织量,较少的样品，在沉淀时刻加入糖原，增加终浓度等。,影响,RNA,提取的因素,材料,：,新鲜，切忌使用反复冻融的材料,如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在,TRIzol,或样品贮存液中，于,80,保存,液氮,长期保存,，,80,短期保存,样品破碎及裂解,：,根据不同材料选择不同的处理方法：,培养细胞：,通常可直接加裂解液裂解,酵母和细菌,：,直接液氮研磨，之后用,Trizol,裂解,动植物,组织：,先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解,。有些样品如肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨，以充分研磨。,为,减少,DNA,污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；,经典,的沉淀方法,，如,LiCl,沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成,RNA,降解,；,异丙醇,沉淀，用时短，但所获得的,RNA,杂质较多；,柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响,RNA,后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,RNA,提取常见问题,RNA,的降解,OD,260,/OD,280,比值偏,低,总量,偏低,RNA,降解,样品,取样以及保存是否得当,裂解液的质量,外源,RNase,的污染,裂解液的用量不足,组织裂解不充分,另外某些富含内源酶的样品,(,如脾脏，胸腺等,),，很难避免,RNA,的降解。,OD,260,/OD,280,比值偏低,蛋白质污染：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,减少起始样品量，确保裂解完全、彻底,苯酚残留：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,抽提试剂残留：,确保洗涤时要彻底悬浮,RNA,，并且彻底去掉,75%,乙醇。,设备,限制：,测定,OD260,及,OD280,数值时，要使,OD260,读数在,0.10 - 0.50,之间。此范围线性最好。,用水稀释样品：,测,OD,时，用水,作为稀释液将导致比值的降低。,总量偏低,跟组织本身的,RNA,丰度有关，一般代谢旺盛的组织,RNA,得率会比较高。,解决方案：加入糖原，帮助,RNA,沉淀,多提几管，最后合并溶解。,正常条带,常见的几种,RNA,条带,植物叶片,水生生物和昆虫等 “ 隐裂”现象,真菌和细菌等,动物组织,谢谢,