蛋白质分子生物学改造和表达

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质的化学修饰：,通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构的发生改变的过程。,非必需部分的修饰：,不影响蛋白质的生物活性。,必需部分的修饰：,影响蛋白质的生物活性 。,蛋白质的化学修饰,1,影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有两方面：,蛋白质功能基的反应活性；,修饰剂的反应活性；,化学修饰反应的主要类型：,酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应,主要对巯基、氨基和羧基等侧链进行修饰,2,第,五讲,蛋白质的修饰和表达,重点：,蛋白质的分子生物学改造,重组蛋白的表达,难点：,蛋白质的分子生物学改造,3,第,一,节 蛋白质的分子生物学改造,天然蛋白质在生物体中含量一般较低，难以提取和大量制备，限制了它的推广应用。,重组,DNA,技术的建立，使人们在很大程度上摆脱对天然蛋白质源的依赖。,这一原理已成功地应用于酶制剂的工业生产。,(丹麦,Novozymes,80%),4,对于存在于自然界中的任何蛋白质来说，采用重组DNA技术克隆其基因，在特定宿主细胞中进行表达，可以获得运用于商业用途的纯化的产品。然而，这些蛋白质的理化特性常常不能适应实际需求，这是就需要采取适宜手段对这些,蛋白质的理化特性进行改造。,5,蛋白质工程设计可以采用,定点突变,和,体外分子定向进化,两种方式对天然酶分子进行改造。,定点突变,需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。,体外定向进化,是在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能。,6,定点突变技术可以随心所欲地在已知,DNA,序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。,一、定点突变,7,PCR反应,在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、四种脱氧三磷酸核苷酸（4dNTPs）、耐热性多聚酶、Mg,2+,和两个合成的DNA引物。模板DNA94变性1 min，引物与模板4060退火1 min，72延伸2 min,扩增条件：9460 s,3760 s,72120 s,共2530个循环。,Mg,2+,浓度调到最佳，其浓度变化范围为110 mmol/L。Mg,2+,过量易生成非特异性扩增产物，Mg,2+,不足易使产量降低。,8,Step 2: overlap and extension,Step 1: Introduction of mismatch and,amplification of AD and BC fragments,Overlap,B,C,D,A,C,B,D,A,B,C,D,A,3overlapping strands extension,B,A,PCR amplification,Final PCR product with introduced mutation,重叠延伸PCR,9,定点突变的应用一：,通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性,例：,葡萄糖异构酶,（,Glucose isomerase,）,用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以,Pro138,替代,Gly138,，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的,热半衰期比野生型长一倍，最适反应温度提高,1012,C,。,据分析，可能由于,Pro138,替代,Gly138,引入的一个吡咯环刚好能够填充,Gly138,附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。,10,定点突变的应用二：,通过引入二硫键提高蛋白的稳定性,蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。,11,绿色荧光蛋白（,Green fluorescent protein, GFP,）,是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。,GFP,可作为一种“荧光标签”被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。,定点突变的应用三：,GUS报告基因的突变,12,诺奖获得者：钱永健、下村修、约翰森,13,GFP蛋白三维结构,14,GFP的不同颜色,Green-GFP,blue-BFP：蓝色荧光蛋白,Cyan-CFP ：深蓝色荧光蛋白,Red-RFP：红色荧光蛋白,Yellow-YFP：黄色荧光蛋白,15,然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。,同时，已有的结构与功能相互关系的信息远远不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求，因此目前采用,体外分子定向进化,的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就。,16,二、蛋白质的体外分子定向进化,易错,PCR（Error prone PCR）,DNA 搅乱重组（DNA shuffling）,17,易错PCR（Error prone PCR）,是一种相对简单、快速、廉价的,随机突变方法,。它通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn+和Mg+的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。,18,DNA shuffling,于1994年由美国的 Stemmer提出。这种方法不仅可以对从随机突变文库中筛选出来一组突变基因人为进化，还可以将具有结构同源性的几种基因进行体外重组,（Family shuffling),，共同进化出一种新的蛋白质。,通过这种方法产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白质多种特性的共进化。,DNA改造,19,单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的,DNA,片段，具有互补3,，,末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR在不同模板上随机互补结合，最后利用基因两端的序列为引物合成全长重排产物。,20,DNA shuffling过程示意图,21,当,DNA shuffling,用来重组一系列进化上相关的基因时，就称为,Family shuffling,。,应用举例：,当将,4,种头孢菌素酶基因进行,Family shuffling,时，酶活最高可增加,540,倍，而单基因,shuffling,只增加,8,倍。,22,最近两年在,DNA shuffling,的基础上又延伸出了,StEP(Staggered extension process),重组,、,随机引物体外重组,(Random-priming in vitro recombination, RPR),、,临时模板随机嵌合生长,(Random chimeragenesis on transient templates, RACHITT),等定向进化方法。,23,突变体的筛选,表型观察选择,在鉴定平板上产生的,水解圈,或,变色圈,在微量滴定板上培养并测定酶活,自动酶标分析仪,大大提高筛选的速度,高通量筛选方法：,表面展示技术，酵母双杂交系统,24,25,产气荚膜梭菌,产生卵磷脂酶分解卵磷脂使卵黄琼脂平板菌落周围出现乳光浑浊带,26,27,28,29,三、基因的融合,采用DNA重组技术将不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后，可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。,构建融合蛋白的基本原则是：,将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达。,30,为蛋白质的表达和纯化提供方便,与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白,与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达,防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解,改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST,蛋白表达的空间定位：信号肽,蛋白质结构和功能的研究,获得蛋白质的途径（通过体外切割）,利用融合技术表达外源基因的缘由：,31,（一）基因融合的策略,1. 基因融合的方式,信号肽+基因,信号肽+基因+插入序列,32,2. 融合蛋白接头设计和选择,将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接作用的氨基酸链即为linker，Linker的长度一般是在10-15个氨基酸之间。,33,若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原。,应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使两个大分子相距最近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，linker序列的组成对融合蛋白的折叠有重大影响。,34,另外，在设计linker序列时，尽量避免二级结构的产生，linker中常见的氨基酸是非极性的疏水氨基酸（Gly、Ser等）,(GGGGS),3,(SG),5,35,融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（,Affinity tail,）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，,使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。,poly-Arg,poly-His,（二）融合蛋白标签,36,蛋白纯化,蛋白质的检测和定向固定,提高重组蛋白质的产量,增强重组蛋白质的可溶性及稳定性,融合标签的功能,37,（三）融合蛋白报告分子,将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选。,38,作为报告分子必须具备以下特点：,1报告分子应不存在于宿主中且易于和内源性基因相区别；,2 应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子；,3报告分子的分析结果应具有很宽的线形范围，以便于分析启动子活性的幅度变化；,4报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。,39,（四）蛋白质剪接-内含肽,自1998年发展起来的一种新的蛋白质工程技术称为“表达蛋白连接”或“内含肽介导的蛋白连接”。通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成C端带有硫酯键或N端带有半胱氨酸的蛋白质分子。,两种蛋白质混合以后，硫酯键和半胱氨酸利用,自然化学连接,原理进行自发连接反应，硫酯键和半胱氨酸间直接形成肽健，从而将两种蛋白质连接起来。,内含肽：,在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前,体,蛋白的氨基酸序列。,40,自然化学连接,是从蛋白质半合成研究中发展起来的技术，,其基本原理是：,C端带有,-硫酯的合成肽与N端带有半胱氨酸的合成肽或蛋白质混合后，硫酯和半胱氨酸之间会发生高效的化学反应，形成的硫酯键将两个蛋白质分子连接起来，随后的S-N酰基重排将硫酯键转变为肽健。,41,（五）tRNA介导的蛋白质工程,在蛋白质合成过程中，每个氨基酸都有一个对应氨酰tRNA合成酶和至少一个转移RNA，氨酰tRNA合成酶负责把正确的氨基酸加载到对应的tRNA上，tRNA带着氨基酸被其他酶运到核糖体，在核糖体里tRNA反密码子与信使的RNA的密码子匹配，氨基酸从tRNA转移到肽链中，因此DNA的遗传信息被转移到蛋白质中的氨基酸序列。,42,在蛋白质工程中，借助于矫正tRNA定点参入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息，改进蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某些新的特性。,43,第,二,节 重组蛋白质的表达,基因工程为目标蛋白质的生产，对其结构功能的研究以及蛋白质及多肽药物的开发在理论和实际应用上开辟了一条崭新的途径。,44,现阶段蛋白质异源表达的关键问题就是发展克隆基因的表达方法，即找到理想的宿主表达系统。目前常用的表达系统有细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞等，这些表达系统各有优缺点。,45,Escherichia coli,E.coli,常与一些食源性疾病有关，但从人体肠道内分离出来的两种命名为K-12和B的良性大肠杆菌菌株却是两种重要实验用菌株。,大肠杆菌K-12的基因组的测序工作已于1997年完成。,而大肠杆菌B菌株自1918年被分离出来后，在1959年被分离为两类实验用菌株：一类REL606用于研究长期计划作用；另一类BL21(DE3)在医学和工业上用于生产蛋白质。,由美国、韩国和法国的科学家组成的研究小组完成了对两种实验室常用的大肠杆菌(,E.coli,)菌株基因组的测序工作。这项研究发表在Journal of Molecular Biology杂志上(2009.10.17)。,基因组大小4.6M bp,，,单个碱基对差异是非随机分布的。,46,Yeast,芽殖是酵母最常见的无性繁殖方式，即从细胞壁上产生芽体，形成子细胞，一般的酿酒酵母都是芽殖的。酿酒酵母于1996年完成基因组测序。,芽殖酵母和裂殖酵母听起来是近亲，但实际上它们在约亿到亿年前就分家了，走上不同进化道路。2001年诺贝尔生理学或医学奖获得者、英国帝国癌症研究基金会的保罗纳斯领导的小组完成裂殖酵母基因组测序工作。成果发表在自然杂志上。,裂殖酵母的基因组含有3条较大的染色体，约1380万个碱基对。分析表明，裂殖酵母只有4824个编码蛋白质的基因，是真核生物中最少的，比芽殖酵母少1000个左右，甚至比一些细菌还少。有50个基因与人类疾病基因很相似，其中约一半与癌症有关。,47,Nature,459, 657-662 (4 June 2009) | doi:10.1038/nature08064,Evolution of pathogenicity and sexual reproduction in eight Candida genomes,Candida species are the most common cause of opportunistic fungal infection worldwide. Here we report the genome sequences of six Candida species and compare these and related pathogens and non-pathogens. There are significant expansions of cell wall, secreted and transporter gene families in pathogenic species, suggesting adaptations associated with virulence. Large genomic tracts are homozygous in three diploid species, possibly resulting from recent recombination events. Surprisingly, key components of the mating and meiosis pathways are missing from several species. These include major differences at the mating-type loci (MTL); Lodderomyces elongisporus lacks MTL, and components of the a1/2 cell identity determinant were lost in other species, raising questions about how mating and cell types are controlled. Analysis of the CUG leucine-to-serine genetic-code change reveals that 99% of ancestral CUG codons were erased and new ones arose elsewhere. Lastly, we revise the Candida albicans gene catalogue, identifying many new genes.,六种假丝,酵母,（,Candida,）的,基因,组序列已被确定，并与白念珠菌（一种海洋酵母和面包酵母）的,基因组,序列进行了对比。假丝酵母是人类所遭受的伺机性真菌感染的最常见原因。,基因,组对比显示了与致病性物种相关的惊人的基因家族扩展现象。假丝,酵母,生物学的其他方面，包括,遗传,编码的演化，以及交配和减数分裂过程的架构，也可通过对不同物种进行对比来研究。,48,各种表达系统的优缺点：,细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，,易被菌体蛋白酶破坏,。,Trxtag,Histag,thrombin,STag,enterokinase,目标蛋白,硫氧还蛋白标签,凝血酶,肠激酶,49,酵母表达系统,既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。但它蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。,50,毕赤酵母表达外源蛋白有如下特点：,在成分简单的培养基中细胞就能迅速生长至,130g,干重细胞,/L,发酵液；,在,AOX1,基因启动子和终止信号调控下，以甲醇作为细胞生长唯一碳源时，,外源蛋白,大量表达，其表达量可占胞外蛋白总量的,30-70%,；,在酵母,-Factor,前导序列作用下，具有很强的外源蛋白分泌能力，可将95%以上的,外源蛋白,分泌至胞外；,发酵液含杂蛋白少，目标蛋白纯化容易，纯化成本低。,51,昆虫表达系统,优点是能较高水平地表达不同动物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-5天后，细胞就裂解，幼虫即死亡。,52,哺乳动物细胞,是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。,53,大肠杆菌表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系。,优点：,技术操作简单,易培养,外源基因常可高效表达,不足：,不可进行典型的真核细胞所具有的翻译后,修饰。大肠杆菌本身含有内毒素,一、目标蛋白质在大肠杆菌中的表达,54,载体分类,克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。,表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表达的载体。,55,（）复制起始点,（）选择性基因（一般为抗生素抗性基因）,（）强的、可诱导的启动子,（）强的转录终止序列,（）核糖体结合位点,（）合适的多克隆位点,（一） 表达载体包括的成分,：,56,1. 启动子结构对表达效率的影响,转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤，因此要选择强的可诱导的启动子及相关的调控序列。,（二）与外源基因有效表达的相关因素,57,强启动子：高水平的外源蛋白的表达。,一个高效的启动子应具有的特点：,1. 必须是较强的启动子，表达效率在10-30%；,2. 由启动子控制的本底转录很低；,3. 启动子能够由一些简单及经济合算的方式诱导启动；,T7启动子是大肠杆菌表达系统的主流启动子，,Novagen公司pET系列载体。,启动子,58,59,有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。,原核生物两种机制：,依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止；,rho非依赖性转录终止；,发卡结构,2. 转录终止区对外源基因表达的影响,60, mRNA的稳定性：细胞内mRNA的浓度是由mRNA转录的速率和mRNA降解之差来决定的。, 翻译的起始：无效的翻译起始多半是蛋白质低表达的最常见的问题。, 翻译的延伸：遗传密码的简并。, 氨基酸的错误搀入, 翻译的终止,3. 有效的翻译与基因的高效表达,61,每种生物对简并密码子的使用频率的差异；,同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量相关；,某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，CCG是脯氨酸最常用的密码子；,富含宿主不常用密码子的外源基因有可能得不到有效表达。,4. 密码子偏好性,62,大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位在胞内、胞质膜、胞周质、外膜、胞外培养基五个位置。,（1）胞内表达：,小分子蛋白易表达、易水解。大分子蛋白，胞内表达易形成包涵体。,5. 外源蛋白的表达定位,63,（2）外周质表达：,外源基因与信号肽融合，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠 外周质中蛋白质降解的也少，外周质中总蛋白少（4%），目的蛋白容易纯化。,（3）细胞外分泌：,利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。分泌至培养基的蛋白容易纯化，减少内源蛋白酶裂解。,64,（4）胞质膜定位：,常用于含有跨膜区的膜蛋白的研究，,G蛋白偶联受体，具有重要的生理和药理学作用。,（5）菌体表面定位：,大肠杆菌表面蛋白与外源肽或蛋白融合，表达外源肽或蛋白的菌株可用于构建活菌苗、筛选文库，研究蛋白与配体的相互作用、细胞间的粘附等。,65,菌株内蛋白酶太多会导致外源蛋白表达产物不稳定，选用蛋白酶缺失的宿主菌。,BL21系列是lon和ompT蛋白酶缺陷型；,BL21(DE3)溶源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计；,K12衍生菌Origami 2系列菌株可提高细胞质中二硫键形成几率。,6. 宿主菌选择对表达的影响,66,增加细胞培养密度，如分批培养和连续培养；,改变培养基的组成及培养条件有时也可以改善外源基因的表达水平。,7. 宿主菌培养条件控制对表达效率的影响,67,（三）真核基因在原核细胞中表达及调控,真核基因的特点：,启动子不能被原核识别；,mRNA上没有SD序列；,基因内部含内含子；,产物往往需要翻译后加工；,易被原核酶系降解。,因此，在原核细胞中表达时应注意三个问题：,基因编码区必须连续；,必须置于原核启动子、终止子和SD序列的控制之下；,产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。,68,酵母表达系统,既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。,二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达,69,1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达,2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株,3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达,毕赤酵母与其它表达系统相比有许多优点,70,4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离,5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用,6、使用方便、简单，而且成本较低,71,甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性；,筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵；,培养基和培养条件不成熟；,因此，人们开始研制不以甲醇为唯一诱导物的启动子：GAP、FLD1、DAS、AOX2等启动子。,毕赤酵母表达系统的缺点,72,（一）表达菌株,酿酒酵母,Saccharomyces cerevisiae,巴斯德,毕赤酵母,Pichia Pastoris,Koichi Ogata等人于1969年首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，此后，用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注；,1987年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg )，随后Philip Petroleum公司与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就开始了毕赤酵母表达系统的合作开发；,1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给Research Corporation Technologies公司，并委托,Invitrogen,公司进行有关产品销售。,73,毕赤酵母,Pichia Pastoris,常见菌株：,GS115,KM71,PMAD11,PMAD16,74,（二）表达载体,毕赤酵母表达载体,75,GC-MS analysis of the fatty acid composition of total lipids from,P. pastoris,GS115 transformants. A:,P. pastoris,GS115 containing vector pPIC3.5KD6 with no methanol induced; B:,P. pastoris,GS115 containing vector pPIC3.5KD6 with 0.5% methanol induced; C: Mass spectrometry analysis of the novel peak identified in,P. pastoris,GS115 transformed with the recombinant plasmid pPIC3.5K-D6.,76,AOX-醇氧化酶,S - 分泌信号,MCS 多克隆位点,TT-终止信号,HIS4-组氨醇脱氢酶,Kanamycin-抗卡拉霉素基因,pBR322-大肠杆菌的复制起始位点,Ampicillin-抗氨苄青霉素基因,毕赤酵母分泌表达载体,77,Sj23蛋白的SDS-PAGE分析,SDS-PAGE analysis of the expressive supernatant of GS115 transformants,M：蛋白质Maker；1：诱导前上清；2-5：酵母转化子诱导96 h后上清；,M: low protein molecular-mass marker; 1: SDS-PAGE results of supernatant before indution; 2-5: SDS-PAGE results after 96 h induction,78,不同诱导时间的表达结果,Expression of Sj23 induced at different time,M：蛋白质Maker；1-8：分别为诱导24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h and 0 h后50 L上清中的蛋白质。,M: low protein molecular-mass marker; lane 1-8: represent 50 L culture supernatant collected at different time points after methanol induction: 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h and 0 h.,79,毕赤酵母多拷贝表达载体,80,多拷贝表达盒的构建原理,Principle of the construction of multi-copy expression cassette,81,82,1. 启动子：AOX1启动子，发展方向：GAP启动子等；,2. 选择标记：,营养缺陷型选择标记,抗性选择标记,3. 信号肽序列,4. 表达载体的转化及与酵母的整合,单交换,双交换,83,（三）外源基因在毕赤酵母中的表达,1. 异源蛋白质在酵母中表达的一般步骤,载体构建,遗传转化,酵母培养,蛋白纯化及与天然产物比较,84,2. 外源蛋白的表达方式,胞内表达,破伤风毒素蛋白表达：12 g/L,胞外表达,85,3. 表达产物的翻译后加工、修饰,毕赤酵母能进行蛋白质翻译后的修饰，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成、O-连接和N-连接糖基化修饰、磷酸化修饰等。因此，大部分表达的蛋白具有天然蛋白质类似的生物学功能。,86,4. 影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素,目的基因的特性,特定的（A+T）富集区,外源基因中mRNA 5-UTR序列及长度,某些稀有密码子,启动子的影响,基因剂量,宿主、整合方式及转化子表型,影响蛋白质稳定的因素,发酵条件的影响,87,三、昆虫,杆状病毒表达系统,88,杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80160 kb，其基因组,可在昆虫细胞核复制和转录。,用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于,核型多角体病毒,。可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。,1、杆状病毒的生物学特性,89,2、杆状病毒载体表达系统的特点,苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 （AcNPV）用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。,90,重组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。,能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力。,相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：,91,表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50。,能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。,92,能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。,杆状病毒对脊椎动物无感染性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统。,93,四、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达,已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。,94,根据进入哺乳动物细胞的方式，可将表达载体分为,病毒载体,与,质粒载体,。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。,1、表达载体的类型,95,质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。,整合型载体,无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在。而,附加体型载体,则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。,整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。,96,常用的表达重组蛋白的细胞株有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。,不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。,2、宿主细胞,97,CHO细胞则利于外源基因的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生长，是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低。,98,根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指表达载体进入宿主细胞后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；,瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。可作为遗传工程构建是否正确的指征。,3、表达系统,99,五、体外翻译系统,体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译系统内的,组分和翻译条件,可以根据需要进行适当的改变。,因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内表达系统具有许多优点如内源性mRNA干扰很小，可以同时加入多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反应混台物中检测。,目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、,E.coli,S30系统3种。,100,兔网织红细胞系统,兔网织红细胞用新西兰大白兔制备，通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分(tRNA，核糖体，氨基酸，起始、延伸、终止因子)。,为了使系统更适于mRNA的翻译，兔网织红细胞中还添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统，以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制，此外还添加了tRNAs混合物用于扩大mRNA翻译的范围，以及乙酸钾和乙酸镁等。,101,麦胚提取物的制备 通过碾磨麦胚，离心去除细胞残渣，上清液通过层析将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素等分离出去。提取物用微球菌核酸酶处理 破坏内源mRNA，最大限度降低翻译背景。提取物中添加磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统和增加链延伸效率的亚精胺，以及一定量的乙酸镁。,麦胚提取物系统可稳定地表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的DNA，比如那些含有低浓度的双链mRNA的模板。此外，麦胚提取物系统缺乏许多在兔网织红细胞中翻译需要的转录因子，因此对于表达真核转录因子是一个很好的选择系统。,麦胚提取物系统,102,S,30原核体外翻译系统的,E,.,Coli,S,30提取物是,由OmpT内切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的,E.Coli,B菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性，尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质。,S30体外翻译系统也适合表达那些在体内表达时由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质，使其能高水平表达。S30系统还可用于转录和翻译调控的研究。此外，S30体外翻译系统的应用还包括台成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺人非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能。,原核体外翻译系统,103,Thank you!,104,