无菌检查与微生物限度检查

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/4,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,无菌检查与微生物限度检查,无菌检查与微生物限度检查无菌检查与微生物限度检查,微生物实验室建设问题,无菌检查常见问题,微生物限度检查常见问题,抑菌效力检查法,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物实验室建设问题,基本原则,防止微生物污染事件的发生（包括对环境、实验人员、试验样品等的）。,有利于试验操作的进行,山东省药品检验所,2020/11/4,USP,对于实验室布局和运作的规定,Layout of the lab should enhance operations,Prevent corss-contamination,Separation of activities,Promote Safty,Lab area should have separate,“,clean,”,and,“,live culture,”,areas,points, barriers,When a sample has growth , all further work in the,“,live culture,”,area,Sampling should take place carefully aseptic conditions,EM equipment should be loaded enviroment to be sampled, and carefully handled,Isolator technology may be useful,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物实验室可单独建设也可共用普通建筑，但应自成一区，单独设立一层，或一层楼的一端。与建筑物其它区域相通的部分应有门相隔。,可按四区域划分：核心实验区、缓冲辅助区、,PII,级生物安全区、一般实验及准备区 。,核心实验区可按具体工作需要划分为数个试验单元，核心区各实验单元最好独立运行 ，核心区与,PII,级生物安全区不得共用一套换风系统，严格控制交叉污染的发生。,各房间应功能明确，不得混用。,药品检验、食品检验、化妆品检验等不得共用无菌室和缓冲间，防止交叉污染。,准备室、洁净室、培养室等布局，应方便物品的传送，设置可以互锁的洁净双扉传递窗，坚决避免直接的空气交换防止交叉污染。,微生物实验室房门应尽量实现自动关闭，缓冲区门为互锁。同一区域内各实验单元房门应朝向同一方向或交错布局，防止直接的空气交换。,山东省药品检验所,2020/11/4,除地面、墙面、顶棚和工作台外，传递窗、物品台、坐凳、门把手等细微环节，也应做到易于清洁，耐腐蚀、不起尘、不开裂、光滑防水，便于消毒。,洁净室内照明、紫外、超净工作台等仪器设备开关易设置在第,1,缓冲间以外，便于控制。,洁净室内各区域的风速、压差、温度、湿度显示等易设置在第,1,缓冲间以外或第,1,缓冲间外可以观察到的地方，便于观察纪录，实时提示屏障系统的有效性 。,洁净区内部和外部宜设置对讲设备，便于实验人员的信息交流和协作。,洁净室内不应安装水槽、水管、上下水道等，避免滋生微生物。,微生物实验室空调系统的设计应充分考虑生物安全柜、恒温水浴、培养箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器等冷、热、湿和污染负荷。,无菌室内不宜放置水浴等对湿度影响较大的仪器，如需要放置应加盖，并经常换水 ，防止微生物滋生,由于实验室建成后，结构布局很难变更，所以应对未来的人员编制、检验内容、工作量、所需仪器做出规划，充分考虑实验室的承载能力，必要时预留部分空间。,山东省药品检验所,2020/11/4,山东省药检所微生物实验室平面图,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物实验室的环境监控,保证微生物实验室安全、有效运行,对实验结果的可靠性做出有力支持,微生物实验室建成后，必须配备相应的环境监控设备：浮游菌采集器、尘埃粒子计数器、风速仪、压差计、照度计和噪声计等等，对于微生物实验室环境保持，以定期监控为主要手段。过多的消毒、熏蒸会对无菌室的通风系统管路和试验仪器造成一定的腐蚀，影响使用寿命，不合理的擦拭反而可能会增加无菌室污染的机会，同一种消毒剂的反复使用可能会使微生物对消毒剂的耐受力增强。因此，应根据监测情况制定相应的清洁计划。,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物实验室的环境监控,环境菌库的建立,方法,定期采集洁净室沉降菌及浮游菌，采用适宜的方法对搜集到的菌株进行鉴定，包括,形态观察、生化鉴定、遗传信息分析（,16sRNA,测序、,DNA,脉冲场电泳分析等）、傅里叶红外光谱分析等，对每一株菌建立详细档案。,目的,1.,分析无菌室环境菌种类、数量、分布随时间的变化关系，制定相应的消毒计划和工作计划。,2.,判断药品检出微生物是否是环境相关菌，是否与本实验室环境菌相关。,山东省药品检验所,2020/11/4,企业生产区域环境菌库的建立,当企业产品的灭菌条件和产品稳定性之间产生矛盾时，该如何处理？,山东省药品检验所,2020/11/4,解决方案：,建立生产过程中关键区域的微生物监控体系，通过长期监控，找出关键区域常见抗性菌株，并据此建立新的灭菌条件。,否则，如果环境中监测到更强的耐热菌株，则应立刻停止生产，进行彻底消毒。,此外,建立环境微生物库和实时监控体系，根据环境微生物的变化规律制定相应防范措施和消毒计划，并可对阳性产品污染环节进行排查堵漏。,山东省药品检验所,2020/11/4,FTIR,法用于药品检出菌与环境菌关联性分析,定期（月）环境菌采集,FTIR,图谱测定,图谱累积汇总,总体环境菌谱库,当月环境菌谱库,药品微生物检查,FTIR,图谱测定,D0.04,D,0.04,非环境菌,疑为内源性环境菌,外源性环境菌,D0.04,D,0.04,环境菌,山东省药品检验所,2020/11/4,将,27,株药物分离菌平均光谱分别代入谱库分析，,11,株,Hit,值,0.04,，占,40.7%,，怀疑与环境菌相关。,其中,7,株分离自六味地黄丸，检出时间：,06,年,9,月。带入当月谱库分析：,5,株,Hit,值,0.04,，而当月正处于无菌室改造未完成时，所以存在本实验环境污染的可能性。,其中四株检出于,06,年,12,月，代入当月谱库分析：,4,株,Hit,值均,0.04,，说明这四株菌可能为外源性环境相关菌。,山东省药品检验所,2020/11/4,2010,年版药典无菌检查法的结果判断解读,（,1,）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。,（,2,）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。,（,3,）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物鉴定分析,工具书,伯杰细菌手册,、,真菌鉴定手册,形态学,生物显微镜（最好带成像系统）,生化鉴定,手工生化鉴定试剂盒（ 例如：,apiweb,TM,鉴定软件价格便宜，国际金标准，应作为常规配备）,全自动生化分析仪（例如,VITKE 2,，价格较贵，可实现大批量检验）,分子生物学,例如,16sRNA,测序、荧光定量,PCR,等，,价格较贵，高速、敏感和特异性，用于,微生物追踪溯源,）,傅立叶变换红外光谱法,Tensor27-HTSXT,型微生物鉴定红外光谱仪 ，快速，用于环境菌监控及微生物鉴定初筛）,山东省药品检验所,2020/11/4,药品微生物鉴定一般程序,未知微生物（来源于供试品、实验室环境、检验过程等等）,选择适宜的培养方式进行纯化培养（培养基的选择，需、厌氧条件，培, 养温度，是否选择振荡培养等等）,观察、描述菌落形态,革兰染色及氧化酶试验、过氧化氢酶试验等（根据染色结果、细菌形态、初步的,生化试验信息和鉴定目的等等选择适宜的鉴定方法）, ,生化鉴定 分子生物学,FTIR,（或几种方法联合使用）,结果分析（综合整个实验过程的所有信息，分析鉴定结果）,结论,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物鉴定分析的意义,检验过程中，不能对所检出的微生物进行鉴定分析或做出一定的说明，就不能算是一次完整的微生物检查试验。,无菌检查法中，增加检出菌检定规定是药典发展的必然趋势。,控制菌判断：由,“,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验,”,改为,“,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,”,注重微生物鉴定能力的提高非常重要！,山东省药品检验所,2020/11/4,无菌检查前言说明,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出,日常检验还需要对环境进行监控,无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。,新增的三点说明，使得本版药典对药品检测机构微生物检验的综合能力及软、硬件配制上，都有了更高的要求。,山东省药品检验所,2020/11/4,对照品培养基,经适用性检查合格的培养基是否可以作为对照培养基使用？,山东省药品检验所,2020/11/4,对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。,山东省药品检验所,2020/11/4,稀释液、冲洗液的问题,如何选择稀释液和冲洗液？,薄膜过滤法中规定总的冲洗量不得超过,1000ml,，而对稀释液没有作出具体规定，稀释液的用量多少为易？,山东省药品检验所,2020/11/4,培养基出现浑浊的判断问题,新版药典规定：,“,取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养,2,天、真菌培养,3,天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,”,为何不再进行直接划线培养？如果使用液体培养物进行革兰染色，培养基成分是否会对镜检观察造成影响？如何解决？,山东省药品检验所,2020/11/4,验证用菌种的问题,验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃希菌。,在验证试验的实践中，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌在验证试验中对大部分抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。,山东省药品检验所,2020/11/4,黑曲霉菌的相关试验污染及防护问题,2005,版中国药典开始使用黑曲霉菌作为试验用菌种，但试验过程中，针对该菌种的安全防护问题仍未得到明确而有效的解决方案，因此，时至今日许多药品检验机构和制药企业仍未开展相关实验。,山东省药品检验所,2020/11/4,黑曲霉菌特性,生长速度快，胞子易通过空气扩散。,在普通环境中生命力较强，传统的紫外线、循环风净化和中低效消毒剂对其作用效果较差，需高效消毒剂方可将其杀灭，例如：苯酚酸类、苯酚碱类等等,不耐热，,70,左右即可被杀灭。,能分泌有机酸和毒素，但关于黑曲霉对人体治病的案例并不多见。,山东省药品检验所,2020/11/4,当前实验室进行黑曲霉试验的通常做法：,采用传统的超净工作台，关闭风机，靠近火焰。,采用生物安全柜,采用负压隔离器,山东省药品检验所,2020/11/4,第一种由于净化台本身属非密闭性操作台，与外界环境的气流交换无法避免，因此，无论是对实验人员、供试品或实验环境都存在严重污染隐患；,第二种方法较第一种方法在一定程度上可以保证供试品和实验人员免受污染，但实验后工作台面的消毒问题，特别是富集于生物安全柜,HEPA,上的黑曲霉胞子较难杀灭、清除，成为潜在污染源。,第三种方法，全封闭的负压隔离系统有效防止了微生物污染问题，且有利于高效消毒剂发挥作用。,山东省药品检验所,2020/11/4,实验室根据黑曲霉菌特性和自身实际，制定一套合理的解决方案。,山东省药品检验所,2020/11/4,微生物限度检查方法选择的原则,供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。,对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。,山东省药品检验所,2020/11/4,计数方法验证过程中供试品稀释级选择问题,没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，可采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。,低稀释剂菌落计数过多，影响方法验证的结果计算，可采用适于方法验证的稀释级供试液进行方法验证试验。,此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是,1,克细菌数不得过,1000cfu,，那么最高稀释级是,1,：,10,-3,。,山东省药品检验所,2020/11/4,计数方法验证的相关问题,何种情况下，可选择更高一级的供试品稀释液进行方法验证和检验？,山东省药品检验所,2020/11/4,供试品采用常规方法检验菌落计数结果不符合规定，是否还要进行方法验证试验？,计数方法验证时，如不能寻找到各验证用菌回收率均能达到要求的有效方法时，该如何进行检查？,山东省药品检验所,2020/11/4,控制菌检查,新版药典增加了,“,控制菌检查用培养基的适用性检查,”,检验项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查,删除,“,控制菌验证时的阴性菌对照组,”,控制菌判断：由,“,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验,”,修订为,“,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,”,大肠菌群检查用培养基：由胆盐乳糖发酵培养基修订为乳糖胆盐发酵培养基。,山东省药品检验所,2020/11/4,控制菌检查,梭菌检查法：增菌培养基、培养时间、结果判断均做了修订。,控制菌检查中增加了白色念珠菌检查：阴道、尿道用药增加了白色念珠菌检查。,山东省药品检验所,2020/11/4,眼用制剂,眼用制剂微生物限度检查修订为无菌检查,由于眼用制剂剂型多、基质复杂，进行无菌检查则大大增加了检品的取样量，特别对于乳状液、乳膏剂、凝胶剂等等抗生素类眼用制剂，采用薄膜过滤法时如何通过滤膜，并有效削除抑菌作用将成为未来无菌检查的一个难点。,山东省药品检验所,2020/11/4,抑菌效力检查法指导原则,抑菌效力试验应包含,3,个基本方面：,“,所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。,”,“,在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力,”,“,应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。,”,山东省药品检验所,2020/11/4,谢谢,