聚合酶链反应及其应用

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,5,2,3,4,1,6,7,8,PCR,的原理与反应条件,PCR,的,DNA,聚合酶与扩增的精确性,PCR,的模板及制备,PCR,的引物设计及合成,PCR,反应的其它控制参数,PCR,技术的衍生与发展,PCR,技术在生命科学研究中的应用,PCR,技术在临床医学方面的应用,聚合酶链反应及其应用,PCR,技术的诞生与发展,1 PCR,的原理与反应条件,PCR,技术的反应条件,PCR,技术的基本原理,PCR,反应的质量指标,PCR,技术的诞生与发展,聚合酶链反应,（,Polymerase Chain Reaction，PCR,）,又称为,PCR,扩增技术,，是一种高效、快速、特异性的体外,DNA,聚合程序。,1985年,，,美国,PE-cetus,公司人类遗传研究室的,Kary,mullis,发明了具有划时代意义的,PCR,技术；,1988年,，,美国,PE-cetus,公司推出世界上第一台,PCR,热循环仪，从而使,PCR,反应自动化；,1993年,，,Kary,mullis,因发明,PCR,技术获得,诺贝,尔化学奖；,1995年,，,定量,PCR,仪诞生，使定量研究,DNA,靶序列成为现实。,PCR,技术的基本原理,5,5,待扩增,DNA,区域,5,变性,加热,5,5,引物,退火,5,5,底物,聚合,5,5,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,1,2,3,5,5,5,PCR,技术的反应条件,DNA,或,RNA,模板,5,5,待扩增,DNA,区域,5,94,5,min,5,5,55,退火,5,5,聚合,5,5,5,5,5,循环,25-30,次,目标,DNA,片段达,10,6,-10,7,变性,70,DNA,引物,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,（,缓冲液）,PCR,反应的质量指标,PCR,反应的质量标准有：,特异性（序列选择）,有效性（序列产量）,上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在,PCR,反应中必须,准确性（序列对错）,对多种参数进行联合控制和改进，但由于,PCR,反应中的各参数往往,是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效,性、准确性。,PCR,扩增反应的精确性,2 PCR,的,DNA,聚合酶与扩增的精确性,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,DNA,聚合酶对,PCR,精确性的重要影响,DNA,聚合酶的使用,PCR,扩增反应的精确性,利用,PCR,技术扩增,DNA,靶序列的一个重要问题是这种,DNA,体外聚,合反应的序列忠实程度，即,DNA,扩增产物序列的,准确率,。,PCR,反应的,准确率远远低于细胞内的,DNA,聚合反应，除了缺少完善的,DNA,聚合校,正系统外，影响,PCR,反应,准确率的因素还包括：,DNA,聚合酶的保真性能（主要因素）,DNA,链的物理损伤,PCR,反应体系的洁净度,DNA,聚合酶对,PCR,精确性的重要影响,DNA,聚合酶的保真性主要取决于其,3,5,的核酸外切酶活性，它,负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，,DNA,聚合酶的,出错率在每轮延伸每核苷酸,1.6,X 10,6,- 2.1,X 10,4,范围内。,DNA,聚合,酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：,与,dNTP,的结合特异性,磷酸二酯键的形成速率,焦磷酸的释放速率,碱基错误掺入之后的持续延伸性,3,5,的核酸外切活性的强弱,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Taq DNA,酶的聚合出错率较高（,2.1,X10,-4,），因为它没有,3,5,的,的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使,Taq,酶的,聚合出错率降低到原来的,1/3,。,Taq DNA,聚合,酶催化的聚合反应的普遍,则,Taq DNA,酶还常常导致扩增产物的缺失突变。,Taq DNA,聚合酶（,Thermus aquaticus,）,错误类型是由,AT,转换为,GC,；,如果模板,DNA,具有形成二级结构的可能性,避免稀释保存,Taq DNA,聚合,酶,Taq DNA,聚合,酶在室温下也具有延伸引物的活性,Taq DNA,酶在使用时应注意：,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,KlenTaq DNA,聚合酶,是一种,N,端缺失了,的,Taq DNA,聚合酶，因而,没有,5,的核酸外切酶活性；,KlenTaq DNA,聚合酶,的,Mg,2+,最佳浓度范围很宽，因此很容易优化,KlenTaq DNA,聚合酶（,Thermus aquaticus,）,在最佳反应条件下，,KlenTaq DNA,聚合酶,出错率为,5.1,X 10,5,，,性能略优于,Taq DNA,聚合酶。,反应条件；,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Tth DNA,聚合酶在,Mn,2+,的存在下，能有效地反转录长度在,1000,碱,基以下的,RNA,；,Tth DNA,聚合酶在,Mg,2+,的存在下，能由,DNA,模板合成,DNA；,Tth DNA,聚合酶（,Thermus thermophilus,）,好地克服,RNA,链中普遍存在二级结构的难题。,Tth DNA,聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此,能很,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Pfu,是一种,高保真,的,DNA,聚合酶，出错率极低；,Pfu DNA,聚合酶扩增出的产物带有平头末端；,Pfu DNA,聚合酶扩增速度极快，达,1.5 - 2,min / kb,；,Pfu DNA,聚合酶（,Pyrococcus furiosus,）,Pfu DNA,聚合酶的热稳定性很高。,7.0,X 10,7,- 1.6,X 10,6,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,Vent DNA,聚合酶具有,3,5,的核酸外切酶活性和校正功能，,因此,与其它,DNA,聚合酶（如,Taq,酶,）相比，具有相对较好的高保真性，其,出错率为,2.4,X 10,5,- 5.7,X 10,5,；,Vent DNA,聚合酶（,Thermococcus litoralis,）,度小于,2,kb,时，扩增产物的长度与,Mg,2+,的浓度并无关联；,如果扩增长度大于,2,kb,，,则需要高于,2,mM,的,Mg,2+,，,而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，,Vent,DNA,聚合酶不能延伸引物。,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,DeepVent DNA,聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的,聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和,DMSO,等；,DeepVent DNA,聚合酶能产生长达,14,kb,的扩增产物，其,外切酶,DeepVent DNA,聚合酶（,Pyrococcus species GB-D,）,活性,比,Vent DNA,聚合酶高,4,倍，聚合活性比,Taq DNA,酶高,5-15,倍，,度小于,2,kb,时，扩增产物的长度与,Mg,2+,的浓度并无关联；,如果扩增长度大于,2,kb,，,则需要高于,2,mM,的,Mg,2+,，,而在扩增长,如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，,Vent,DNA,聚合酶不能延伸引物。,出错率,比,Vent DNA,聚合酶低,2,倍；,用于,PCR,的,DNA,聚合酶简介,UlTma,是一种高保真的,DNA,聚合酶，可以较高的产量扩增小于,3,kb,的,DNA,靶序列，产物呈平头末端。,UITma DNA,聚合酶（,Thermotoga maritima,）,DNA,聚合酶的使用,DNA,聚合酶的标准使用范围：,1 - 5,Units /,m,L,特异性的改进：,在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。,聚合酶的浓度是决定,PCR,反应成本的,的重要参数，浓度,过高不仅能降特异性，同时也导致不必要的消耗。,准确性的改进：,建议使用高保真的,DNA,聚合酶,PCR,模板制备与纯化,3 PCR,的模板与制备,PCR,模板的使用,粗样品中的,PCR,抑制剂,PCR,模板制备与纯化,DNA,和,RNA,均可作为,PCR,扩增反应的模板，但一般情况下，,mRNA,先逆转录成,cDNA,再进行扩增。,PCR,模板的来源主要有两大类：,纯净物,如重组质粒、制备的染色体,DNA、,回收的,DNA,片段,粗样品,如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、,尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷,嚏液、痰液等,上述粗样品,含有大量的,PCR,反应抑制物质，因此如何,去除,这些种类,繁多的,抑制剂,或者,添加,必要的,PCR,反应,增强剂,显得十分重要。,PCR,模板制备与纯化,从各种,粗样品中去除,PCR,反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的,手段包括：,样品稀释,溶剂萃取（,氯仿,异戊基乙醇 491,）,乙醇沉淀,高速离心,超滤,粗样品中的,PCR,抑制剂,粪便,胆盐、胆红素（抑制浓度50,m,g / mL）,血液,亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、,heparin（,抗凝剂）,土壤,腐殖物质、含铁化合物,植物,硫酸右旋糖苷,食品,未鉴定的抑制剂,痰液,未鉴定的抑制剂,PCR,模板的使用,PCR,模板,的标准使用范围：,10,2,- 10,5,拷贝,特异性的改进：,增加模板,DNA,的量、降低引物与模板的分子比,有效性的改进：,增加引物与模板的分子比,模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般,而言，模板,DNA,长度小，,PCR,扩增产物的量就大，因此对于大分子,量的模板,DNA,（,尤其是真核生物基因组,DNA,），,在扩增之前最好先,用超声波处理或限制性酶消化,。,PCR,引物的设计原则,4,PCR,的引物设计及合成,PCR,引物的使用,引物的在线设计工具及免费软件简介,PCR,引物的设计原则,选择合适的引物是,PCR,实验设计的重要步骤，合适引物最基本的,引物的长度,标准就是与靶序列的,高特异性杂交,。为达到此目的，引物设计应注意,下列几点：,理想的引物长度应该在,18-30,个碱基之间，常见的是,20-27,个碱基,PCR,引物的设计原则,引物的,GC,含量,引物序列中的,GC,含量应在,35% - 65%,之间，最好在,45% - 55%,范,围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有,过高,的,GC,碱基，那么就,在其,5,端设计一串,A,或,T,；,同样，如果引物中的,AT,含量过高，就在其,5,端设计一串,G,或,C,，,以便将整条引物的,GC,含量控制在合适的范围内。,PCR,引物的设计原则,退火温度（,Ta）,引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低,5,左右，在很多,情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到,4-,6,，,尚,不至于影响,RCR,扩增反应的产量，但它们的退火温度应在,55-75,范围,引物碱基,20,，,Ta,= 4 X（G+C）+ 2 X（A+T）,-,5（）,内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长,较低,Ta,值,的引,物的,3,端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或,5,端。,引物的,Ta,值估算有多种公式，最好根据,RCR,试剂盒建议的计算方,法，例如,Alkami Quick Guide,试剂盒建议的计算方法如下：,引物碱基,20,，,Ta,=,62.5 + 0.41 X（GC%）,-,500 /,长度,-,5（）,PCR,引物的设计原则,杜绝互补区域的存在,引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域的存在。,为扩增后操作提供便利条件,在不影响扩增反应特异性的前提下，可在引物的,5,端引入诸如限,限制性内切酶识别位点、启动子序列等有用的非模板序列，以便于扩,增后操作。,PCR,引物的设计原则,引物与模板的互补程度,在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到,100%,互补，但,检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域,为了减少,PCR,扩增产物的污染本底，在设计引物序列时应检查模,板,DNA,上是否存在潜在的引物同源区域。,尽可能高的互补程度是必要的。,PCR,引物的设计原则,选择内含子序列作为引物序列,在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员之间，其内含,引物的末端序列,在引物的两端设置,1-2,个,嘌呤碱基,，最好在引物的,3,端,避免,G,或,C,这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入的机会。,引物,3,端,子序列也是随机多样性的。,至少应有,1-2,个碱基必须是特异性的。,引物的在线设计工具及免费软件简介,The Primer Generator（TPG）,TPG,是一种基于,CGI,数据库便利的用于定点突变的引物设计工具。,只要在网页上相应的位置中键入不超过,15,个碱基的短核苷酸序列、所,期望的氨基酸序列、以及允许替换的最大碱基数，设计工具便会提供,满足初始要求的所有可能的引物序列，还能显示酶切位点的消失或增,加。但,TPG,的一个明显缺陷是不能计算引物的,Tm,值并判断其稳定性。,引物的在线设计工具及免费软件简介,Primers!,/javascript/,Primers!,是一种基于,Java,的引物设计程序，可以选择所期望的引物,长度、最大,Tm,值、最小,Tm,值、误配碱基对数等四种参数输入引物序列,其特殊的优点是能限定所输入的序列中适合引物设计的区域，这对检索,若干,kb,长的,DNA,片段中各种可能的引物是很有利的。而且能根据三种计,算方法显示正反向引物的,Tm,值，可以随意更换碱基以提高或降低,Tm,值,同时还能提供引物稳定性的参数，包括发夹结构、引物二聚体、引物相,似性等。缺点是不能计算发夹结构、引物二聚体的响应,Tm,值。,引物的在线设计工具及免费软件简介,其它的在线设计网站,Web Primers,Project DOPE2,NetPrimer,Oligos-U-Like Primers3,PCR,引物的使用,PCR,引物,的标准使用范围：,0.1 - 1.0,m,M，,最好,0.2 - 0.5,m,M,特异性的改进：,降低,引物,和,dNTP,的浓度可以在很大程度上改,有效性的改进：,增加引物与模板的分子比；,如果引物中有不配,善,PCR,扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性,的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模,板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板,的分子之比。,对的碱基，则适当降低引物的浓度。,5,PCR,反应的其它控制参数,脱氧三磷酸核苷酸（,dNTPs,）,预热变性温度和时间,Mg,+2,离子,退火杂交温度和时间,延伸聚合温度和时间,循环次数,反应体积,脱氧三磷酸核苷酸（,dNTPs,）,dNTPs,的标准使用范围：,20 - 200,m,M,特异性的改进：,降低,dNTPs,的浓度，但要注意,Mg,+2,的摩尔浓度,有效性的改进：,对于较大分子量的模板，应适当,提高,dNTPs,的量,如果一种,dNTP,的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成,扩增产物的不准确，因此要保持四种,dNTPs,的,一致,。此外，保,持四种,dNTPs,的浓度,略高于,DNA,聚合酶对各种,dNTPs,的,Km,值也,很重要（,10-15,m,M,）。,也应同步降低。,准确性的改进：,降低,dNTPs,的浓度，但要注意,Mg,+2,的摩尔浓度,也应同步降低。,Mg,+2,离子,Mg,+2,的标准使用范围：,0.5 - 10,mM,特异性的改进：,降低,Mg,+2,浓度，但要注意过低的,Mg,+2,浓度又会影,有效性的改进：,提高,Mg,+2,浓度，但过量,Mg,+2,将,导致非特异性扩增,游离的,Mg,+2,离子浓度应,高于,dNTPs,总浓度,0.5-3.0,mM,。,由于,Mg,+2,能与,dNTPs,形成可溶性的复合物，过低浓度的,Mg,+2,离子将会影响,dNTPs,的有效浓度。,Mg,+2,的浓度影响扩增产物的特异性、引物退,火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，,PCR,反应系统的,主要优化参数,是,Mg,+2,的浓度，尤其当扩增产物大,大于1,kb,时，这个因素显得更为重要。,响,扩增产物的产量。,预热变性温度和时间,预热温度和时间,的标准使用范围：,92 - 96 30,secs - 10 mins,在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时,又能保证模板的完全变性，尤其是基因组,DNA,直接作为模板使用,时，更显得重要。,变性温度和时间,的标准使用范围：,92 - 96 30,- 120 secs,退火杂交温度和时间,退火温度和时间,的标准使用范围：,37 - 65 10,- 120 secs,退火时，引物迅速杂交。不同,DNA,聚合酶所拥有的,Tm,值的差异,会改变有效的引物退火温度。,特异性的改进：,提高退火温度（比建议退火温度提高,2-5,）；,减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，,只会增加非特异性引物杂交的可能性。,延伸聚合温度和时间,延伸聚合温度和时间,的标准使用范围：,72 60,- 120 secs,PCR,扩增反应中普遍使用的,DNA,聚合酶的聚合速度每秒至少,50,个碱基，所以如果,PCR,扩增产物长度小于,400,bp,，,聚合时间可以少,于,15,秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些,单体掺入。较长,PCR,产物的扩增需要相应延长反应时间，但最好要,比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反,应滞后作用。,循环次数,在一定的循环次数下，,PCR,反应的最终产量可由下式估算：,由上式可以看出，,PCR,产物呈指数扩增，但当然产物拷贝数达到,10,12,（阈值）时,产物的扩增速度一般急剧下降。达到这个阶段所需要的循环次数可由下式计算：,影响上述扩增阈值的主要因素包括：,扩增底物（引物和,dNTPs,）,有效浓度的下降,N,f,= N,0,X 2,N,其中,N,为循环次数，,N,0,为起始拷贝数，,N,0,为最终拷贝数,N,f,= N,0,（1 + Y）,N,非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用,反应试剂的稳定性,扩增产物抑制作用,高浓度产物的退活作用以及不完全变性,特异性的改进：,降低循环次数，减小扩增片段长度。,有效性的改进：,对于,1,kb,以上片段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。,反应体积,反应体积,的标准范围：,20 - 100,m,l,（0.5 ml,的小离心管,）,有效性的改进：,增加反应体积以及保温时间，以充分保证热平衡；,5,m,l,的反应体积也有成功的例子。反应体积过大会影响加热和冷,却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产,量，甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置,也能影响各循环步骤所需的时间。,对于,100,m,l,以下的反应体积还应该用油封顶，以减少反应体系的,蒸发浓缩效应。,6,PCR,技术的衍生与发展,LA PCR,（,Long and Accurate PCR）,RT PCR（Reverse Transcriptase）,原位,PCR（In Situ PCR,）,定量,PCR（,Quantitative PCR,）,锚定,PCR（Anchored PCR）,多重,PCR（Multi PCR）,反向,PCR（,Inverted,PCR）,不对称,PCR（,Asymmetric,PCR）,LA PCR,（,Long and Accurate PCR）,LA PCR,是一种专门用于精确扩增较长,DNA,片段的特种,PCR,程,序，其关键的技术是结合使用两种热稳定的,DNA,聚合酶，可以扩增,出,5 - 40,kb,的,DNA,大片段。两种酶的配比如下：,其中，,Pfu,和,DeepVent,起着二次校对的作用。,KlenTaqPfu = 161,KlenTaqDeepVent = 501,RT PCR（Reverse Transcriptase）,RT-PCR,是一种以,mRNA,为模板，经,cDNA,扩增出,DNA,的技术，,能极其灵敏地检测到任何基因的转录物，而与,mRNA,的相对量无关。,标准的,RT-PCR,程序包括：,mRNA,的分离,cDNA,反应的引物退火,mRNA,反转录为,cDNA,cDNA,的,PCR,扩增,引物选择有三种战略：,基因特异性引物化（,GSP），,最精确最灵敏,寡聚,dT,引物化,随机六聚体引物化,反向,PCR（,Inverted,PCR）,通常,，,PCR,反应是对两条引物之间,的序列进行扩增，但如果将模板,DNA,稍,酶切,环化,酶切,扩增,做处理，即可实现对已知序列两侧的片,段进行扩增，这种战略称为,反向,PCR,技,术,。,不对称,PCR（,Asymmetric,PCR）,在,PCR,扩增循环中引入不同,的引物浓度，使得由两条引物介,导扩增反应呈不对称状态，这种,战略称为,不对称,PCR,技术。,不对称,PCR,中的两条引物浓,度一般采用,50-100,1,的配比，,在最初的,10 - 15,个循环中，主要,产物还是双链,DNA,，,但当低浓度,的引物耗尽后，高浓度引物引导,的,PCR,反应便会产生大量的单链,原位,PCR（In Situ PCR,）,原位,PCR,是,PCR,技术,与原位杂交技术结合的产物。原位杂交技术,可以检测到,10,个拷贝的,DNA,或细胞，而原位,PCR,技术能,使杂交的灵敏,度提高,10,倍，也就是说人们可以在,1,m,g,的细胞,DNA,样品中检测到,1,个拷,贝的特定,DNA,序列。,一个典型的原位,PCR,程序包括下列四个步骤：,待检测的组织或细胞用甲醛溶液固定,用蛋白酶对细胞进行通透性处理，确保,PCR,试剂能进入细胞,对,DNA,或,RNA,靶序列进行胞内原位扩增,PCR,扩增产物通常用地高辛系统标记，,色谱检测仪检测,定量,PCR（,Quantitative PCR,）,理论上讲，,PCR,产物以指数规律增殖，但在所有的扩增循环（尤,其是后十轮）中，众多引物-模板分子上的反应由于抑制剂的作用并非,100%,的有效，因此精确定量,PCR,产物必须使用,内标,（扩增对照）。,贝的特定,DNA,序列。,内标使用相同的引物，与待测样品具有相似的长度、碱基组成以,及对抑制剂的敏感性，但又必须与待测样品有所区别，以便在扩增产,物检测分析时能够辨认（如引物的检测方式不同）。,C,0,/ X,0,= C,n,/ X,n,X,0,= C,0,（,C,n,/ X,n,）,其中，,C,0,和,X,0,分别为内标和待测样品的初始拷贝数，在,1,10,到,10,1,的范围内最佳；,C,n,/,X,n,分别为内标和待测样品的扩增产物分子比,多重,PCR（Multi PCR）,加入多对引物，对同一,P1,P2,P3,P4,P1,P2,P3,P4,正常人扩增物,病人扩增物,模板的若干区域进行同,时扩增。适用于绘制真,核生物庞大基因或基因,组中的缺失图谱，如分,子病的临床辅助诊断。,锚定,PCR（Anchored PCR）,反转录,AAAAA,3,5,3,GGGGGGGG,TdT,锚定引物,锚定,PCR,又称为,cDNA,末端快速扩增,PCR，,主要用于5,端序列未知的,cDNA,的扩增和克隆。,5,5,5,dGTP,5,5,CCCCCCCC,PCR,3,GGGGGGGG,5,5,CCCCCCCC,3,PCR,5,CCCCCCCC,5,特异性引物,7,PCR,技术在生命科学研究中的应用,特定,DNA,序列的克隆与重组子的鉴定,PCR-SSCP,检测基因序列,DNA,洗牌术（,Shuffling）,染色体,DNA,的引物原位杂交,DNA,的体外定点突变与分析,同源重组子的检测,特定,DNA,序列的克隆与重组子的鉴定,GAATTC,GGATCC,GAATTC,CTTAAG,GGATCC,CCTAGG,PCR,扩增,PCR,产物克隆,EcoRI,BamHI,PCR,鉴定,DNA,的体外定点突变与分析,PCR,扩增,突变位点,变性复性 除去引物,延伸 加外侧引物,同源重组子的检测,同源整合,目的基因,同源交换,目的基因,整合位点,PCR,扩增,PCR,扩增,PCR-SSCP,检测基因序列,将,PCR,技术与,单链构型多态性,（,SSCP,）,分析技术联合使用，可以,有效地检测和分析基因序列的突变性质。在,非变性,的聚丙烯酰凝胶电泳,条件下，单链,DNA,由于分子内的作用力而形成卷曲构型，即便是单一碱,基的突变也会导致整条单链,DNA,的,构型发生变化，并被检测。,采用,不对称性,PCR,程序扩增待分析的靶基因序列，获得特异性,单链,DNA，,然后在,非变性条件下走聚丙烯酰凝胶电泳，与对照样品进行比较,即可检测出可能存在的碱基突变类型。,染色体,DNA,的引物原位杂交,通过荧光探针使染色体发光是细胞遗传学的一种绘图技术，涉及到,荧光原位杂交,（,FISH,，,Fluorescent In Situ Hybridization,）和,引物原位,杂交,（,PRINS,，,Primed In Situ hybridization,）程序，用于基因图谱绘,制、染色体畸形展示、基因表达、基因组构成、感染病定性、病毒整合,位点调查等方面。,PRINS,是,FISH,和,PCR,的结合：首先使寡聚核苷酸引物与处于,M,期的,染色体,DNA,退火，,然后在荧光标记的核苷酸和,Taq DNA,聚合酶的存在下,进行延伸反应，合成一系列长度在,200-1000,bp,之间,的,荧光探针，进而,绘制细胞染色体的彩色图谱。,DNA,洗牌术（,Shuffling）,随机切割成,20 - 50,bp,的小片段,DNA,同源序列,混合退火,PCR,扩增,克隆,高通量筛选,8,PCR,技术在临床医学方面的应用,PCR,检测病原体,PCR,临床诊断术,PCR,检测病原体,临床上检测病原体通常有三类方法：,病原菌和病毒的生物培养富集,病原菌和病毒的抗原免疫检测,病原菌和病毒核酸特征序列的,PCR,检测,相比较而言，,PCR,检测,法在很多情况下不需要培养富集待检测样品,这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病毒、真菌,厌氧菌、支原体等；,PCR,检测,法比免疫分析法更廉价；,PCR,检测,法,可以使用多重引物同时检测若干种病原微生物。为数不,少的,PCR,检测程序已自动化，包括样品预处理、扩增反应、产物检测。,PCR,临床诊断术,PCR,临床疾病诊断术的主要原理有下列几个方面：,检测病变基因的缺失或缺损,（扩增产物变小或无扩增产物）,检测病变基因的点突变,（扩增产物电泳迁移率改变）,检测病变基因的重排,（扩增产物大小改变）,上述方法可以诊断包括各类遗传病、恶性肿瘤、免疫紊乱在内的多,种疾病，但始终没有获得美国,FDA,的批准，其主要原因是,PCR,诊断术的,检测染色体易位,（扩增产物大小改变）,骨髓移植的,PCR,指纹图谱快速配型,（随机引物扩增）,检测病变,mRNA,的结构,（,扩增产物大小改变）,可靠性还受到置疑，有时使用不同的程序会产生两种截然不同的结果。,