真核生物基因组DNA的提取电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学实验,1、 欢迎大家参加分生实验的学习！,2、 分生实验的重要性；,3、 每组,2,人，做一份实验；,4、 守纪律，听老师安排，穿白衣；,5,、 同学们在听课时要作好记录,;,6,、 上课时间、课间休息。,1,考试形式,实验成绩考核占总成绩,40%,，满分为,40,分,。,缺实验,课,成绩者，本课程不予通过。,随堂考试（,10,分）,(,主要考察理论课与实验课结合内容,),闭卷考试（,15,分,),(,实验方法及原理、实验结果及注意事项、仪器设备操作及注意事项和对失败结果的原因的分析,),实验设计（,15,分）,(,实验名称、实验目的、方法和步骤预期实验结果、关键问题讨论及参考文献,),2,实验课安排,实验一 基因组,DNA,的提取,实验二,PCR,及琼脂糖凝胶电泳检测,实验三,PCR,产物的限制性酶切片段分析,实验四 总,RNA,的提取及逆转录,实验五,PCR,产物的,TA,连接,实验六 转化,实验七 质粒的提取、酶切鉴定,实验八 讨论及实验课考试,3,实验课安排,1.,提取基因组,DNA,重组质粒,6.,连接产物转化,无质粒的,E.Coli,死亡,有质粒的,E.Coli,存活,2. PCR,获取目的基因,7.,重组质粒提取及酶切鉴定,质粒,5. TA,连接,4. RNA,提取与逆转录,T,载体,平板筛选,4,一、加样器的使用及注意事项,1、 用途,2,、 使用,2.1,根据取样量，选择合适的加样器。,5,ul、50ul、500ul，,应选择哪个加样器,?,顶部标有加样器的,最大量程，,分别为：,20ul:,0.5,20,l,100/200ul: 20,100/200,l,1000ul: 200ul,1000,l,实验仪器的使用及注意事项,5,练习：加样器读数为,10,0，实际体积各为多少,?,2.2,如何调节,？,(1),首先观察目前读数,假设为,050:,1000,l: 500,l,100,l: 50,l,20,l： 5,l,(2),顺时针调节- 读数变小,逆时针调节- 读数变大,(3),注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度,。,6,2.3,加样器使用步骤,(,示教及学生练习,),：,6,）,(,吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！,),贴容器内壁，将液体,匀速,打出，加样器推到,第二挡。,观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内,.,5,）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去,4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器,;,完全放开拇指后，停留约半秒钟,急于离开液面，容易吸入空气。,3）将吸头插入液面下适当,深度,，过深可能会腐蚀加样器,过浅可能会吸入空气。,2）吸取液体前，先打到,第一挡。,1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要,紧密,。,不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下,7,1、打开电源,2、离心管中的液体为,2/3,盖紧,盖子,防止离心机被腐蚀。,二、离心机的使用注意事项,1,代表转速盘上方的数据，,2,代表下方的数据。,3,、样品,配平,对称放入离心机,(,管的连接处朝外,).,4,、设定离心时间,(,如设定2分钟，可定时多点时间，再用手表记时,),。,5,、,统一离心,，逐渐升到要求转速。,8,实验一、真核生物基因组,DNA,的提取和电泳,9,一、 实验背景,高等生物的基因组相当宠大。,真核细胞基因组约含万个结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的,研究的起点就是要获得纯度高不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好以便有足够量用于分析；基因组相对完整不断裂的基因组以便用于以后,PCR,分析，,RFLP,分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。,10,掌握小鼠肝脏组织模板,DNA,的提取技术。,学习,DNA,琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。,第一部分 ：肝组织制备、蛋白酶,k,消化,第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀,第三部分：,DNA,琼脂糖凝胶电泳,三、实验材料 小鼠肝脏组织,四、主要试剂（稍后讲解）,二、 实验目的,五、实验步骤（马上讲解）,11,1,.,取新鲜小鼠肝组织（约,300-500mg,）,，,小米粒大小，组织块不宜过大, 放在毛玻璃片上立即研磨,研磨要彻底。,2.,将研磨后的肝组织转移至加有460,l NE,溶液的,EP,管中，混匀。,实验第一部分 小鼠肝组织的制备、蛋白酶,K,消化,注意事项,组织磨得越细越好。,细胞中含有大量的,DNA,酶，因此，第一步的操作（,EDTA,：抑制酶活性）应迅速，以免细胞裂解，释放出,DNA,酶，使,DNA,降解。,12,注意事项：,离心时离心机内样品平衡后对称放置,加样器加样准确。,加样器使用提示： （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到,第一挡,，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到,第二挡,。观察吸头内液体是否完全打出。,1000,r/m,离心,5min,(统一离心)，将上层细胞悬液转移至另一,EP,管中，用,NE,溶液补足至,500,l,，弃掉下层大块的组织沉淀。,加30,l 10%SDS,迅速混匀。,加50,l,蛋白酶,K(20mg/ml),混匀，置50水浴50,min,。,13,一、核酸提取的主要步骤,真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步,:,1),破碎细胞,2),去除蛋白质，糖类等等生物大分子,；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的,DNA,的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对,DNA,的剪切，从而获得相对完整的,DNA,3),沉淀核酸,14,乙醇沉淀,SDS,裂解,蛋白酶,K,消化,琼脂糖电泳,PCR,DNA,提取步骤图解,酚氯仿抽提,15,作用：,a,.,阴离子型去污剂,，溶解细胞膜、核膜上脂质成分,b.,使蛋白质变性,c.,将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用,成分：,N: NaCl 50mM,E: EDTA.Na,2,25mM (PH:8.0),作用：,金属离子螯合剂，抑制,DNase,的活性,(,螯合,DNase,发挥活性所需的2价阳离子,),。,二、各种试剂的作用,1,、,NE,溶液,：,2,、,SDS ：,十二烷基硫酸钠 终浓度0.5%,3,、蛋白酶,K(,或链霉蛋白酶),作用：,广谱蛋白酶，能在,SDS,和,EDTA,的存在下保持很高的活性，,降解蛋白质，将,DNA,游离。,16,重蒸酚,:,酚的作用是变性蛋白质，而对,DNA,结构没有影响。,无色,酚的氧化产物,(,如醌等,粉红色,),破坏磷酸二脂键。,重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。,TE,溶液:,Tris-HCl 10mM (pH:8.0),EDTA.Na,2,1mM (pH:8.0),作用：提供略碱的,pH,值，保证,DNA,溶于水相。,在酸性条件下，,DNA,分配于有机相。,8-,羟基喹啉：0.1% 黄色酚相指示剂 抗氧化剂,作用：,去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚,。,4,、,TE,饱和重蒸苯酚：,成分：,17,氯仿作用：,a.,氯仿的变性作用不如酚好，,但与酚共同,/,交替使用可,增强去蛋白效果,；,b.,氯仿有加速有机相和水相的分离、,去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；,5,、酚/氯仿,6,、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1),氯仿的作用：,去除,DNA,水溶液中残留的微量酚。,异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。,18,在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使,DNA,发生沉淀,。,8,、无水乙醇,：,作用：提供,单价阳离子,。,7,、醋酸钠：3,M NaAc pH: 5.2,核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。,最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、,NaCl、,氯化锂、氯化钾等,常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等,19,1、,加入,580ul(,等体积,)TE,饱和酚,混匀1,min. 10000rpm,2min,。,(,注意抽取下层酚相,;,轻柔混匀，避免,DNA,链断裂,;),实验第二部分、酚氯仿抽提,DNA,及乙醇沉淀,5、加入2-2.5倍体积无水乙醇（1,ml,）,混匀后置,-70,沉淀,10min,。,4、 取,300ul,上清至一新管中，加入1/10体,积（约,30ul）,醋酸钠于上清中充分混匀。,3、,将,400ul,上层水相移至一新管中。加入,400ul(,等体积,),氯,仿-异戊醇，,同上条件,混匀后离心。,2,、将,500ul,上层水相,移至一新管中，加入,500ul(,等体积,),酚,/,氯,仿，,同上条件,混匀、离心。,(,注意要尽量抽尽，又不可吸起,酚相,),。,20,注意事项：,1） 本实验将用到的,TE,饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而,DNA,溶解在水里，我们,总是取上清。,；,2,） 在,抽取完苯酚、氯仿等,有机试剂，,不能将加样器平放或倒置,，以防液体导流损坏加样器,，,加完样后立即弃掉加样器头。,。,3,）基因组,DNA,由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组,DNA，,尽量不要多次进行物理性操作。,21,一定要,充分,溶解沉淀,7,、加入,15,l,双蒸水，溶解沉淀，-20保存。,6,、10,000,r/min,离心,5min,，,吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体,(,勿触及,DNA,沉淀,),，,37,孵箱干燥至沉淀变透明。,9,l,：进行,电泳,6,l,：,PCR,模板（用于下次课实验）,弃上清,黄头,滤纸条,(,吸干内壁液体,),观察,DNA,沉淀的颜色。,离心,22,实验第三部分、,DNA,质量检测,-,琼脂糖电泳,一、琼脂糖凝胶电泳原理,DNA,分子在,pH 8.0,的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。,电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的,DNA,电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的,DNA,片段跑在前面。,23,2.,上样：,在样品中加,1ul 10,上样 液，混匀，加入上样内,各组按顺序上样,二、,琼脂糖凝胶电泳实验操作,制备琼脂糖凝胶电泳（,1%,）,实验老师准备,3.,电泳：,110,120V,，30分钟,24,三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂,上样液成份：,10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂）,2,40%,蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重利于加样）,电泳缓冲液：,TAE,为例,T: Tris,碱,A:,冰醋酸,E: EDTA,提供有一定缓冲能力的,pH,值(8.0),EDTA,可抑制,DNase,溴化乙锭（,EB,）：染色剂,一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到,DNA,或,RNA,的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。,致癌剂,25,线性,DNA,片断大小（,kb）,琼脂糖浓度（%）,5 60 0.4,0.8 10 0.7,0.4 6 1.0,0.2 4 1.5,0.2 3 1.75,0.1 3 2.0,思考： 凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？,四、 琼脂糖凝胶的浓度,26,五、 电泳仪的使用方法,稳压,:,电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。,如箭头所示。,27,六、预期结果,如果是,Smear,带，说明所提基因组,DNA,的断裂现象严重。,1 2 3 4 5 marker,理想结果,28,思考题：,1.,本实验中所用到的各试剂的作用是什么,?,蛋白酶,K, SDS, TE,饱和酚，氯仿,乙醇, EDTA,2.,DNA,提取过程中有哪些注意事项？,29,实验结束后整理实验台,值日生值日,!,预习：,1. PCR,的基本原理,2. PCR,的反应体系,3. PCR,引物设计原理及注意事项。,下次实验课, PCR,扩增获得目的基因,30,