实验叶绿素的提取理化性质和含量测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验中的注意事项：,1,、实验的取材,2,、操作及观察,3,、实验数据的处理,4,、实验结果的分析：分清错误和误差,5,、思考题,6,、实验报告,1,实验四 叶绿素的提取、理化性质和含量测定 （,p130,136,）,一、叶绿素的提取,二、叶绿素的理化性质,三、叶绿素含量的测定,2,1.,实验目的,1,）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法,2,）了解叶绿素的理化性质,3,2.,实验原理,2.1,用含水的有机溶剂提取叶绿素,2.2,叶绿素的物理性质,吸收光谱,荧光现象,2.3,叶绿素的化学性质,取代反应,皂化反应,4,2.1,用,含水的,有机溶剂提取叶绿素,亲水的,卟啉环的“头部”,:,镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。,亲脂的,叶绿醇的“尾巴”,:,叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。,5,2.2,叶绿素的物理性质,2.2.1,吸收光谱,2.2.2,荧光现象,2.2.3,含量测定,6,2.2.1,叶绿素的吸收光谱,7,2.2.2,荧光现象,透射光下,反射光下,叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（,LHC,），,LHC,将其能量传递到,PSII,或,PSI,。其间所吸收的光能有所损失，大约,3%-9%,的所吸收的光能被,重新发射,出来，其波长较长,也即叶绿素,荧光,。,叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。,8,分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长,叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。,9,2.2.3,含量测定,叶绿素,a,、,b,在红光区的,最大吸收峰,分别位于,663 nm,和,645 nm,；,叶绿素,a,、,b,在,652 nm,处有,相同的比吸收系数,（,34.5,），测,OD,652,求出叶绿素,a,、,b,总量。,故叶绿素浓度,C,OD,652,/ 34.5 ( mg/ml ),叶绿素的含量（,mg/g,）,= ,叶绿素的浓度,提取液体积,稀释倍数,/,样品鲜重,10,2.3,叶绿素的化学性质,2.3.1,叶绿素的结构,2.3.2,取代反应,2.3.3,皂化反应,11,2.3.1,叶绿素的结构,叶绿素,a,与,b,很相似，不同之处仅在于,Chla,第二个吡咯环上的一个甲基,(-CH3),被醛基,(-CHO),所取代即,Chlb,。,12,2.3.2,取代反应,2.3.2.1,稀酸,去镁,铜代,2.3.2.2,浓酸,去镁,水解,卟啉环中的,Mg,处于不稳定的状态，可被,H,+,、,Cu,2+,、,Zn,2+,等离子取代。,13,2.3.2.1,稀酸,叶绿素溶液与稀酸,(,如,:,草酸,),作用，,H,+,取代,Mg,后的产物为褐色的去镁叶绿素；,去镁叶绿素与,Cu,2+,或,Zn,2+,作用，,Cu,2+,等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；,2.3.2.2,浓酸,叶绿素溶液与浓酸,(,如,:,盐酸,),作用，除了代换,Mg,外，可使去镁叶绿素迅速,分解,出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。,14,叶绿素去镁叶绿素铜代叶绿素,（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）,15,2.3.3,皂化反应,叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被,甲醇酯化,，另一个被,叶绿醇酯化,。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。,叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。,16,皂化分层,叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，,不能进入苯层,；,而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中,一部分苯分散在水中形成,乳胶体,，出现一层乳白色的溶液,低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。,17,3,材料、试剂与配备,1,材料,菠菜叶片,2,仪器设备,研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶,(25ml,50ml),，分光光度计，水浴锅等,3,试剂,95%,乙醇，苯，浓盐酸，,36%,乙酸，,CuSO,4,，,MgCO,3,，,石英砂,18,4,实验步骤,4.1,叶绿素的提取,4.2,叶绿素的物理性质,透射光颜色,反射光颜色,4.3,叶绿素含量的测定,4.4,叶绿素的化学性质,取代反应,皂化反应,19,4.1,叶绿素的提取,1.,新鲜菠菜叶片，,去掉中脉,后的样品称重,(,约,2-3g,记录样品重量,),；,2.,剪碎入研钵中，加少量石英砂和,碳酸镁粉,及,2-3 ml,的,95%,乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；,3.,过滤到,25 ml,容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇,定容至,25ml,(,后称原液,),，摇匀。,20,4.2,叶绿素的荧光,取,3,ml,叶绿素提取,原液,，观察其透射光、反射光下的颜色；,21,4.3,叶绿素含量的测定,取,5 ml,叶绿素提取原液移入至,50 ml,容量瓶，,95%,乙醇定容,(,稀释液,),以,95%,乙醇作为空白对照，测,OD,652,叶绿素浓度,: C,OD,652,/ 34.5 ( mg/ml ),叶绿素的含量（,mg/g,）,= ,叶绿素的浓度,提取液体积,稀释倍数,/,样品鲜重,22,4.4,叶绿素的化学性质,4.4.1,取代反应,4.4.1.1,稀酸：,取,3 ml,叶绿素原液，一滴滴加入醋酸,(,先快后慢,),，观察并记录颜色变化；,向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量,CuAc,颗粒，,65,水浴加热，观察并记录其颜色变化。,4.4.1.2,浓酸,取,3 ml,叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化。,4.4.2,皂化反应,取,3 ml,叶绿素提取原液，加,1 ml 20% NaOH-,甲醇溶液，摇匀，,65,水浴,5 min,；,取出冷却后，先加,3 ml,苯，后加,3 ml,水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。,23,5,结果记录与数据处理,颜色变化,/,分层,原 理,荧光现象,取代反应,醋酸, CuAc,浓,HCl,皂化反应,上层,中层,下层,表,1,叶绿素的理化性质,5.1,实验现象记录与分析,24,5.2,叶绿素含量计算与分析,叶绿素浓度,: C,OD,652,/ 34.5 ( mg/ml ),叶绿素的含量（,mg / g,）,=,叶绿素的浓度,提取液体积,稀释倍数,/,样品鲜重,以样品重为,3g,为例,:,= C ,（,2550 / 5,）,/3,= OD,652,/,（,34.53,）,（,2550 / 5,）,25,6,注意事项,操作应在弱光下进行,？,研磨时间尽可能短，以不超过,2,分钟为宜,分光光度计的正确使用,(,更换波长后要调,0,),皂化反应最后做,在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在,30,40,的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。,26,7,思考题,1,提取叶绿素时为何要加入,MgCO,3,？,2,为何选用,652 nm,测叶绿素的含量？,3,解释皂化反应的分层现象,27,实验五 硝酸还原酶活性的测定（,p124,127,）,28,