工业酶制剂——蛋白酶

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,工业酶制剂,蛋白酶,xx,1,蛋白酶是催化肽键水解的一类酶。,凡是能水解蛋白质的酶,在刚合成时都没有活性,被称为酶原。以无活性形式合成酶有利于酶的贮存及在机体内的输送、转移。这种无活性的酶原可以通过自催化反应或通过金属离子进行活化。,2,1 产蛋白酶菌种研究状况,1956,以来，我国陆续选育了一批优良产酶菌种，其中包括,中性蛋白酶生产菌枯草杆菌,1.398,S114,172,放线菌,166,，栖土曲霉,3.942,；,碱性蛋白酶生产菌地衣芽孢杆菌,2709,，短小芽孢杆菌,289,，,209,；,酸性蛋白酶生产菌黑曲霉,3.350,，宇佐美曲霉,537,，肉桂色曲霉,No.81,，,浆油工业用的米曲霉,3042,。,美国曾规定，用在食品和药物的蛋白酶生产菌种都需经食品和药物管理局批准， 并严格限制在枯草杆菌，黑曲霉，米曲霉三种菌的菌株。,3,2 酶蛋白的分类,：,按酶蛋白的作用方式分：,内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，产物是短肽。,外肽酶：切开蛋白质末端肽键形成少一单元的肽链和游离氨基酸，作用于氨基端的叫氨肽酶；作用于羧基端的叫羧肽酶。,水解蛋白质或多肽的酯键。,水解蛋白质或多肽的酰氨键的。,4,按酶的来源分类：,植物蛋白酶。,动物蛋白酶。,微生物蛋白酶。,按酶的最适pH分类：,酸性蛋白酶，最适pH2.0-5.0。,中性蛋白酶，pH7-8。,碱性蛋白酶，pH9.5-10.5。,为方便起见，微生物蛋白酶常用此分类法。,5,按酶的活性中心功能基团分类：,丝氨酸蛋白酶（Serine protease)。,胰蛋白酶，糜蛋白酶，凝血蛋白酶等,巯基蛋白酶（Thiol protease）。,木瓜酶，无花果酶，某些链球菌蛋白酶,金属蛋白酶（Metallo protease）。,许多微生物的中性蛋白酶,6,3关于蛋白酶的专一性,蛋白酶的专一性一般情况下, 不是针对底物的专一性, 而是针对某些肽键的特异性, 不管蛋白质的分子有多大, 但组成蛋白质的氨基酸的种类基本是一致的, 蛋白质一级结构的不同, 主要体现在氨基酸的比例和彼此排列顺序的差异。蛋白酶的专一性主要是由于形成肽键的两氨基酸的性质不同所决定的。,7,蛋白酶的底物专一性和水解肽链的能力,不仅受到切开点一侧或两侧相邻氨基酸残基的影响,甚至受间隔了若干单位的氨基酸残基的影响.底物专一性上的微小差异,产生的生理功能可能完全不同.如胰蛋白酶,凝血酶和透明质酸梅,三者在选择性切开碱性氨基酸羧基侧的肽键这点上,有共同之处,但作用于血纤维蛋白时,三者切开的肽键数不同.凝血酶使血液凝固,透明质酸梅相反,起溶血作用,胰蛋白酶切开肽键最多,但两种作用都很微弱.,8,4. 微生物蛋白酶的酶系组成,细菌蛋白酶:枯草杆菌等芽孢杆菌生产中性或碱性蛋白酶,有些只一种,有些两种皆产.,霉菌蛋白酶:曲霉中米曲霉,黄曲霉及栖土曲霉以中,碱性蛋白酶为主;黑曲霉以酸性蛋白酶为主;根霉,青霉,担子菌主要生产酸性蛋白酶.,酵母蛋白酶:除解脂假丝酵母产生碱性蛋白酶外,大多数产酸性蛋白酶.,放线菌蛋白酶:生产中,碱性蛋白酶.,9,5 主要蛋白酶及其性质,酸性蛋白酶,主要来源: 酸性蛋白酶主要来源于哺乳动物的消化道, 如胃蛋白酶; 部分微生物是酸性蛋白酶的主要来源, 如:目前的商品酸性蛋白酶制剂主要是由黑曲霉发酵生产的。,10,一般性质:, 分子特性: 酸性蛋白酶的最适pH在2-5范围, 酶蛋白的等电点在pI3-5, 分子量MW30,000-35,000。, 催化特性: 酸性蛋白酶的最适温度因来源不同而有差异, 一般霉菌的蛋白酶的最适温度较高, 大部分在50-60范围, 而来源于动物胃粘膜的蛋白酶的最适温度较低, 一般在40左右, 但酸性蛋白酶的热稳定性都较差, 一般在50都很快失活, 此外, 酶的热稳定性还受到基质的pH的影响; 有些酸性蛋白酶不耐低温, 在低温条件下,很快失活。许多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，对酶的稳定有益。,11,酸性蛋白酶的活性中心,大多酶在其活性中心含两个天冬氨酸残基.,斋藤曲霉酸性蛋白酶中与活性相关的氨基酸是一个色氨酸,3个组氨酸和近20个酪氨酸,但色氨酸不在活性中心,而是牢固地结合在酶分子的疏水键上,有稳定构象的作用.,拟青霉酶分子中含-SH基.,12,底物专一性:,许多霉菌产生的酸性蛋白酶需要较大分子的底物, 对蛋白质的专一性较胃蛋白酶低, 胃蛋白酶作用过的底物蛋白, 可进一步用霉菌的酸性蛋白酶进行水解。,几乎所有来源于霉菌的酸性蛋白酶, 能裂解胰蛋白酶原的赖氨酸和异亮氨酸之间的肽键(Lys6Ile7), 将胰蛋白酶原激活, 利用此特异性, 可鉴别酸性蛋白酶制剂是来源于霉菌或其他来源。,13,中性蛋白酶,中性蛋白酶是最早用于酶制剂工业化生产的蛋白酶, 目前的微生物生产的商品酶制剂的菌种主要有: 枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲霉、栖土曲霉。,除上述微生物生产中性蛋白酶外, 来源于植物的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等都属于中性蛋白酶。,14,一般性质:, 分子特性: 大部分微生物产生的中性蛋白酶属于金属蛋白酶, 一分子酶蛋白含有一个锌原子, 酶蛋白的分子量在35,000-40,000范围, 等电点pI 8-9, 微生物蛋白酶中, 中性蛋白酶的稳定性最差, 分子之间最容易发生自溶, 即使在低温条件下, 也会发生明显的自溶, 造成分子量明显降低。,15, 催化特性: 中性蛋白酶的热稳定性较差, 如 枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7, 60处理15min, 失活90%; 栖土曲霉的中性蛋白酶在pH7, 55处理10min, 失活80%以上; 以酪蛋白为底物时, 枯草杆菌蛋白酶的最适pH7-8、热解蛋白芽孢杆菌的中性蛋白酶的最适pH7-9、栖土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5; 最适温度受测定时的反应时间有直接关系, 因为酶蛋白的稳定性较差, 所以反应时间的长短影响着反应结果, 一般在10-30min 最适温度为45-50。钙离子可以增加酶蛋白的稳定性,并减少自溶。,16,关于中性蛋白酶的活性中心,大部分微生物产生的中性蛋白酶的活性中心有一个锌离子, 锌离子起着酶蛋白与底物之间的桥梁作用,有些酶蛋白还含有钙离子, 钙离子具有稳定酶蛋白空间构象的作用; 此外, 钙离子还与酶蛋白的热稳定性有关, 含有钙离子的酶蛋白的热稳定性明显优于不含钙离子的蛋白酶。,利用酶蛋白的分子修饰技术, 研究发现, 利用EDTA螯合作用除去中性蛋白酶的锌离子, 然后置换成钙离子, 这样制备的中性蛋白酶结晶比原酶蛋白的活力提高了3倍。如果用锰离子置换锌离子, 酶活力提高56%, 并且提高了酶蛋白的热稳定性。,17,关于酶蛋白的专一性,微生物产生的中性蛋白酶的最适底物是 Z-Gly-X-NH2, 其中X是疏水性氨基酸, 如果是丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、组氨酸时, 酶蛋白的活力明显升高。,18,碱性蛋白酶,碱性蛋白酶主要是由微生物产生, 微生物中主要是细菌的部分菌种产生碱性蛋白酶, 目前碱性蛋白酶主要是用于洗涤剂、皮革工业、丝绸脱胶。,19,生产菌种,几乎所有的细菌碱性蛋白酶都是胞外蛋白酶, 主要包括两类: 其一是在中性条件下生产的碱性蛋白酶, 如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等; 其二是嗜碱微生物, 其必须在碱性条件下pH8-10才能生产的碱性蛋白酶。,20,一般性质, 酶蛋白特性: 碱性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小, 一般在20,000-34,000Da, 而且等电点较高, 一般在pH8-9。, 催化特性: 大部分碱性蛋白酶的最适pH在7-11范围, 当以酪蛋白为底物时, 最适pH为9.5-10.5, 碱性蛋白酶除能够水解肽键外, 还具有水解酯键的能力和转肽能力, 最适温度因菌种不同而有差异, 一般在50 左右, 酶蛋白的热稳定性不高, 50-60处理15分钟, 几乎有50%的酶活力丧失, 我国目前生产的几种碱性蛋白酶的热稳定性一般都在60以下。,21,碱性蛋白酶的活性中心,碱性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶, 其活性中心的主要功能基团是丝氨酸, 一部分天然蛋白质能够使碱性蛋白酶失活, 如在土豆、大豆、大麦中含有一种蛋白质是碱性蛋白酶的抑制剂。,22,碱性蛋白酶的专一性,微生物产生的碱性蛋白酶除具有水解肽键的能力外, 还具有较强的水解酯键的酯酶活力, 能够水解各种对硝基苯基酯, 当酶制剂中混有中性蛋白酶时, 可以利用对硝基苯基酯作底物来测定碱性蛋白酶的活力, 以区别中性蛋白酶。,23,根据微生物碱性蛋白酶水解肽键的羧基侧氨基酸的专一性, 可将碱性蛋白酶分为4组:, 对碱性氨基酸有专一性的( Lys Arg )类似于胰蛋白酶的碱性蛋白酶, 对芳香族氨基酸有专一性的(Tyr Phe)枯草杆菌碱性蛋白酶, 对脂肪族氨基酸有专一性的(Leu Ile Val)粘细菌-裂解型蛋白酶, 对酸性氨基酸有专一性的(Glu Asp )葡萄球菌碱性蛋白酶,24,6 蛋白酶的应用,蛋白酶种类繁多，商品蛋白酶不下100种。不同来源的蛋白酶在工业上有不同的用途。蛋白酶已广泛使用在皮革、毛纺、丝绸、日化、食品、酿造、医药等许多行业中。在食品工业中利用蛋白酶制剂，可以避免酸水解、碱水解对氨基酸的破坏作用及变旋，保证蛋白质的营养价值不受影响.,25,蛋白酶在食品工业中的应用,肉类加工中水解结缔组织,嫩化肉类,软化肠衣：利用蛋白酶对肉中的弹性蛋白和胶原蛋白进行部分水解，使肉类制品口感达到嫩而不韧、味美鲜香的效果。提高质量.使用最多、作用最稳定的蛋白酶是木瓜蛋白酶,面包、蛋糕加工中缩短揉面时间，增强面团延伸性。,乳酪制造中可凝固酪素，缩短凝乳时间,酱品制造中用于处理大豆或豆饼粉，提高蛋白质利用率或缩短酱油、豆瓣酱发酵时间,酒类生产中用于啤酒、清酒澄清，防止浑浊:,豆奶生产中利用蛋白酶制剂可使苦涩味及豆腥味等异昧成分游离出来，通过吸附等方式较容易除去，又能提高蛋白质的可溶性而提高蛋白质得率。并且以中性蛋白酶效果最佳。,26,27,其它方面的应用,皮革脱毛软化：酶法脱毛由于酶水解了毛根部的毛囊蛋白使毛松动脱落。软化作用在于分解皮纤维间质中的可溶性蛋白质，使皮纤维进一步松散软化,加酶洗涤剂：提高洗涤效果,生丝脱胶羊毛染色：生丝去除外层丝胶才能具有柔软的手感和特有光泽。羊毛染色，先用蛋白酶处理去除羊毛表面鳞垢，使然色温度降低，染色率大大提高,酶法治疗：如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。,28,谢谢欣赏,29,