体液蛋白质检验-天然药物化学课程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 体液蛋白质检验,概述,体液蛋白质测定,1,一、血浆蛋白质的组成、功能及分类,（一）血浆蛋白质的组成,血浆蛋白质是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90左右，目前已经研究的血浆蛋白质有500多种，分离出的纯品物200来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成。,第一节 概 述,2,（二）血浆蛋白质的功能,1. 维持血浆胶体渗透压,清蛋白。,2. 作为某些物质的载体,如清蛋白能与多种物质结合（FA、胆红素），而某些球蛋白具特异地运输某些物质的功能，运铁蛋白、运皮质醇蛋白。,3. 维持体液pH恒定,血浆蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一部分的弱酸盐形式存在，构成缓冲对。,3,4.免疫功能,血浆中汗多具有免疫功能的球蛋白，主要由浆细胞合成，电泳时位于r区带，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，还有具有免疫作用的非特异球蛋白，如补体。,5.凝血与纤溶作用,凝血与纤溶是一对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器的动脉栓塞。,4,6.营养作用,血浆蛋白质可分成AA，用于合成组织蛋白或氧化供能。,7.催化作用,血浆中有汗多酶类，其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功能性酶，如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝蛋白、LPL、LCAT、肾素等。,5,二、个别血浆蛋白质,（一）前血蛋白,（pueallumun PA）分子量5.4万，由肝细胞合成，电脉时移速较白蛋白快，位于其前方面得名，半寿期短12h，PA是一类运载蛋白，一种能与甲状腺素结合，称为甲状腺结合蛋白，一种能与VitA结合，称为VitA结合蛋白，常用测定方法是免疫化学方法，,【参考范围】,0.20.4g/L,【临床意义】,急性炎症，恶性肿瘤，肝硬化或肾炎时下降。,6,（二）白蛋白,（allumim, ALb）分子量66458，由肝实质细胞合成，半寿期1519天，,是血浆中含量最多的蛋白质，占4060,，主要功能，维持血浆胶体渗透性，缓冲作用，运输作用，营养作用，调节某些激素或药物活性。,白蛋白可微量地通过肾小球，约0.04，但大部分被血小管重吸收。白蛋白的测定方法目前主要是溴甲酚绿（BCG）法。,7,【参考范围】,3555g/L,【临床意义】,血浆白蛋白增高临床少见，主要见于严重失水引起血液浓缩。血浆白蛋白降低临床常见。合成障碍急、慢性肝炎。丢失过多，肾病综合症、慢性肾小球、肾炎、糖尿病、系统性斑狼疮等。分解过多，营养不良，慢性胃肠道疾病。,8,（三）,1,-抗胰蛋白酶,（,1,AT或AAT），分子量5.5万，pI4.8，含糖1012，电泳时位于,1,区带，占90左右，,由肝细胞合成，能抑制多种酶活性，,尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90左右，抑制作用有明显的pH依赖性，在中性和弱碱性中活力最大。,AAT也是一种急性时相反应蛋白，主要功能是对抗多形核蛋白细胞吞噬作用时释放的溶酶体蛋白水解酶。,9,AAT测定方法,目前主要采用免疫化学法。,【参考范围】,成人0.832.0g/L，,【临床意义】,AAT下降见于胎儿呼吸窘迫症，AAT缺陷所致的肺气肿、肝硬化等。AAT上升见于急性炎症、外科手术后，长期服用可的松药物，妊娠及服用避孕药物。,10,（四）,1,-酸性糖蛋白,（,-AG,或AAG）分子量约4万，含糖约45，pI2.73.5，主要由肝细胞合成，某些肿瘤组织也可合成。,AAG是主要的急性相反应蛋白,，急性炎症时上升，与免疫防御功能有关。,AAG测定方法 使用AAG抗体，进行免疫散法或免疫比浊法检测，,【参考范围】,0.252.0g/L,【临床意义】,主要作为急必时相反应的指标，风湿病、恶性肿瘤、心肌梗塞患者上升，营养不良、严重肝病下降。,11,（五）甲胎蛋白（AFP）,分子量6.57万，pI4.75，含糖量4，主要在胎儿肝合成，妊娠1315周血清AFP含量最高，以后逐渐下降，出生时仅为高峰期的1，周岁时接近成人水平，仅1030,g/L，功能不详。,AFP测定方法,火箭电泳放射自显影；放射免疫法（RIA）；酶联免疫吸附法（ELISA）灵敏度接近放免，且操作简便，无放射污染，便于推广。,12,【参考范围】,1030g/L,【临床意义】,AFP作为肿瘤标志物，对原发性肝癌的诊断很有价值，80以上原发性肝癌患者血清AFP上升，但无特异性，肺癌、胰腺癌，肝硬化患者血清AFP亦升高，此外，羊水AFP含量测定可用于胎儿产前监测，AFP增高，提示胎儿畸形（神经管缺损、脊柱裂、无脑儿）死胎。,13,（六）结合球蛋白（ Hp）,又名触珠蛋白，是一种糖蛋白，主要由肝合成，电泳时位于,2,区带，,是一种急性时相反应蛋白,，为两对肽链组成的四聚体（,2,2,）。,链有,1,和,2,两种，其中,1有两种遗传变异体。,Hp的主要功能与血浆中游离血红蛋白结合，（不可逆结合），并送至肝细胞内降解，因此Hp在溶血后含量急剧下降。,14,血浆Hp测定方法,测定Hp-Hb复合物中过氧化物酶活性。在血浆中加入过量Hb，生成Hp-Hb复合物，凝胶层折法收复合物分离，测定结合的Hb。电泳法。免疫化学法。,【参考范围】,0.52.2g/L,【临床意义】,急性时相反应中血浆Hp上升，烧伤、肾病综合征引起Alb丢失时Hp上升，血管内溶血Hp下降。,15,（七）,2,-巨球蛋白（,2,MG或AMG）,是血浆中分子量最大的蛋白质，分子量为62.580万，含糖量8。 AMG由肝细胞与单核吞噬细胞系统合成，半寿期5天。,AMG最突出的特性能与多种分子和离子结合，特别是它能与不少蛋白水解酶结合而影响这些酶的活性，有选择地保护某些蛋白酶活性的作用。,AMG测定方法,免疫化学法，,【参考范围】,1.254.10g/L,【临床意义】,在低蛋白血症，AMG上升，妊娠、服用避孕药时AMG上升。,16,（八）铜蓝蛋白（CER）,含铜的糖蛋白，分子量约1216万，含糖量约10，因含铜而呈蓝色，故名铜蓝蛋白。主要由肝脏合成。,CER具有氧化酶活性，使血液中Fe,2+,氧化成Fe,3+,，故又称亚铁氧化酶。CER还起着抗氧化剂的作用。防止组织中脂质过氧化物和自由基的生成。,CER测定方法,免疫化学法或酶活性测定。,【参考范围】,0.20.5g/L。,【临床意义】,CER属于急性时相反应蛋白。在感染、创伤和肿瘤时上升，Wilson病（肝豆状核变性）CER下降。,17,（九）转铁蛋白（TRF）,血浆中主要含铁蛋白质，分子量7.7万，含糖约6，由肝及网状皮系统合成，半寿期7天。,主要运载由消化道吸收的铁和RBC降解释放的铁，此外还可逆地结合多价金属离子，如Ca、Zn、Cu等。,TRF测定方法,放免法、散射比浊法。,【参考范围】,2.54.3g/L。,【临床意义】,TRF在急性时反应中下降，如炎症、恶性病变时、TRF、Alb、PA同时下降，慢性肝现营养不良亦下降，妊娠、口服避孕药，注射雌激素TRF上升。,18,（十）,2,-微球蛋白（BMG）,由淋巴细胞合成，分子量11800，pI5.7，存在于所有有核细胞的表面，特别是淋巴细胞和肿瘤细胞并由此释放入血，半寿期107min。,BMG测定方法,常用放免法，ELISA法。,【参考范围】,1.02.5mg/L。,【临床意义】,主要用于监测肾小管功能，特别是肾移植后，如有排异反应，BMG在尿中排出量上升，肾功能衰竭，炎症、肿瘤血浆BMG上升。,19,（十一）C-反应蛋白（CRP）,是一种能结合肺炎双球菌细胞壁C-多糖的蛋白质，分子量11.514万，五条肽链组成，肝细胞合成。CRP能激活补体，促进粒细胞、巨噬细胞的运动和吞噬，具有调理素样作用。,CRP测定方法,免疫扩散法，火箭免疫电泳法，ELISA法，放免法，,【参考范围】,8.0mg/L。,【临床意义】,作为急性时相反应的一个极灵敏指标 ，急性心肌梗死，创伤、感染、炎症、外科手术、肿瘤浸润迅速上升。,20,上述蛋白质除PA、Alb、BMG外都属于糖蛋白，含糖量最高的是AAG、45，除BMG外都主要由肝细胞合成。,21,三、疾病时的血浆蛋白质,（一）炎症、创伤,在炎症、创伤、感染、心肌梗塞、肿瘤等情况下其血浆浓度会发生明显改变的蛋白质称为急性时相反应蛋白,（acute phase reactants APR）。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纤维蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。,22,（二）肝脏疾病,血浆蛋白质大多数由肝脏合成，因此肝脏疾病可导致多种血浆蛋白质发生变化。,如乙肝活动期AAT，Hp、PA、Alb，特别是血浆PA的含量是肝功能损伤的敏感指标。,肝硬化时AAT、IgA、AMG，CER、CRP，而AAG、Hp、C,3,，PA、Alb、TRF。,23,（三）肾脏疾病,肾脏疾病可出现蛋白尿而导致血浆蛋白质丢失，丢失的蛋白质与其分子量有关。小分子量蛋白质丢失最明显，而大分子量的蛋白质因肝细胞代偿性地合成增加，绝对含量升高。所以血浆Alb、PA、AAG、AAT、TRF，而AMG、-LP、Hp，这称为选择性蛋白质丢失。,当严重肾病是肾小球失去分子筛作用，可导致非选择性蛋白质丢失，表现为广泛地低血浆蛋白质血症。,24,生化检验中测定蛋白质的方法很多，主要利用蛋白质的分子组成，结构或性质进行。,一、蛋白质测定方法及评价,（一）测定蛋白质特征元素氮,如,凯氏定氮法,，是测定蛋白质的经典方法，1883年Kjeldahl首创，精密度准确度高，但操作复杂、费时、技术性强，不适合临床常规检测，一般,用于标准血清的标定和校正,。,第二节 体液蛋白质测定,25,（二）利用重复的肽链结构,如,双缩脲法,，1914年首创，操作简便，重复性好，各种蛋白产生的颜色反应相近，但灵敏度较低，是目前临床上,测定总蛋白的常规方法,。,26,（三）利用酪氨酸、色氨酸残基与试剂的反应或紫外吸收特性,1. 酚试剂法,1921年，Folin首创，1951年改良成广泛使用的Lowry法，灵敏度高（较双缩脲法高100倍），主要用于微量蛋白质检测，但各种蛋白质中酪氨酸含量不一，故准确性较差，试剂配制复杂且不稳定，化学干扰大，目前临床上仅,用于粘蛋白测定,。,2. 紫外吸收法,在280nm处有一吸收峰，快速、简单，不需加任何试剂，保留蛋白质活性，化学干扰大。,27,（四）利用与染料的结合能力,1. 考马斯亮蓝G-250结合蛋白法（CBB法）,1976年Bradford应用于蛋白质测定，操作简便、快速、重复性好，灵敏度高，干扰因素少，但特异性不高，大分子肽（分子量300以上），也参与反应，线性范围窄，临床上主要,用于尿、脑脊液蛋白质测定,。,2. 溴甲酚绿结合清蛋白法（BCG法）,灵敏度高，血清用量少，操作简便，但特异性不高，部分球蛋白也能与之结合（,1,-球蛋白、运铁蛋白、触珠蛋白等），是目前临床上,测定清蛋白的常规方法,。,28,（五）利用沉淀后借浊度或光折射测定,如比浊法、折光测定法，方法简便，试剂易得，但浊度的强弱受反应的条件影响大（加试剂的方法、温度等），结果准确性差，一般用于,尿、脑脊液蛋白测定,。,（六）电泳法,CAE、PAGE目前临床上常用电泳技术，但只能,测定各种蛋白质的百分含量,。,（七）利用免疫学特性,免疫化学法，特异性、灵敏度高，只能,用于某种特异蛋白的测定,。,29,二、血清总蛋白的测定（双缩脲法）,【原理】,蛋白质分子中的肽链在碱性条件下能与二价铜离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正比，但双缩脲反应并非蛋白质特有的颜色反应，分子中含二个以上肽键者均有此反应。,30,【试剂】,双缩脲试剂 未失结晶水的硫酸铜（CuSO,4,5H,2,O）3.0g溶于500ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠（NaKC,4,O,4,H,6,4H,2,O）9.0g，碘化钾5.0g，待完全溶解后加入6mol/L NaOH溶液100ml，最后加蒸馏水至1L，置聚乙烯瓶内盖紧保存。,酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，维持铜离子在碱性溶液中的溶解度，碘化钾防止两价铜离子还原。,【参考范围】,6080g/L,31,【临床意义】,（一）血清总蛋白增高,1. 血液浓缩,严重腹泻 、呕吐、高烧,2. 合成增加,主要见于球蛋白合成增加，多发性骨髓瘤。,（二）血清总蛋白降低,1.血液稀释,静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴留。,2. 摄入不足和消耗增加,营养不良，慢性胃肠道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲亢、恶性肿瘤。,3. 合成障碍,主要见于肝脏疾患。,4. 蛋白质丢失,严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。,32,三、血清清蛋白测定（溴甲酚绿法）,【原理】,溴甲酚绿（BCG）在pH4.2的环境中，在有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，可与清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一不定范围内与清蛋白含量成正比。,BCG与清蛋白结合的特异性较低，它不仅与Alb结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中,1,-球蛋白，TRF、Hp最明显，但反应速度不同，Alb可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。,33,【试剂】,1. 10mmol/L BCG贮存液,BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸馏水至250ml。,2. 0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH 4.0）,NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸馏水中，用1mol/L NaoH溶液调pH至4.100.05加蒸馏水至1L。,3. 叠氮钠贮存液,叠氮钠40g溶于1000ml蒸馏水中。,4. Brij-35溶液,Brij-35 29g，加蒸馏水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。,34,5. BCG试剂,于IL容量瓶内加蒸馏水400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml，BCG贮存液8ml，叠氮钠贮存液2.5ml，Brij-35溶液2.5ml，加蒸馏水至刻度，配好的BCG试剂的pH应为4.150.05。,Brij-35可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，如无Brij-35可用吐温-20代替，叠氮钠有防腐作用。,【参考范围】,3555g/L。,【临床意义】,35,四、血浆纤维蛋白原测定,血浆纤维蛋白原（Fib）是一种参与血液凝固的糖蛋白，又称凝血因子，分子量34万，在肝脏合成，电泳时位于球蛋白区带。血浆纤维蛋白原测定对于出血性疾病和肝脏损伤的诊断有重要意义。测定血浆纤维蛋白原的方法有多种，主要有：,1.复钙双缩脲法,在稀释血浆中加入钙离子使纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块，将凝块分离后用双缩脲法测定纤维蛋白含量。,36,2.盐析双缩脲法,在血浆中加入12.5%的亚硫酸钠使纤维蛋白原沉淀而与其他血浆蛋白质分离，将纤维蛋白原用双缩脲试剂显色，求出其含量。,3.比浊法,在pH7.0时，用13.3%的硫酸铵溶液沉淀纤维蛋白原，而血浆中其他蛋白质保持溶解状态，此时溶液的浊度完全由纤维蛋白原产生，通过比浊可求得其含量。,4.免疫化学法,用人纤维蛋白原免疫动物获得抗人纤维蛋白原抗体，应用免疫电泳法、免疫扩散法和ELISA法测定纤维蛋白原含量。,37,【参考范围】,2.04.0g/L,【临床意义】,1.纤维蛋白原增加,纤维蛋白原是一种急性时相反应蛋白，在感染、严重组织损伤、休克、肾炎、风湿热、恶性肿瘤以及放射治疗、月经期和妊娠期增高。,2.纤维蛋白原减少,常见于营养不良、严重的肝功能损伤、弥漫性血管内凝血、分娩时羊水进入血液在血管内形成血栓、先天性纤维蛋白原缺乏症。,38,