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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节 色谱分离技术,特点,色谱分离技术最大的特点：,分离效率高,能分离各种,性质极其类似,的物质；,应用化学物质的分析鉴定的同时，,可用于大量物质的分离纯化制备；,如：胰岛素注射药品,以凝胶色谱,去除胰岛素中的二聚体,什么叫作色谱法：,色谱法,（chromatography）又称层析法，,是利用混合物中,各个组分的化学、物理性质的差异,，,基于,被分离物质分子在两相,（一为固定相，一为流动相）,中分配系数的微小差别,进行分离。,一、色谱分离技术的基本概念与理论,什么叫作色谱法：,对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。,一、色谱分离技术的基本概念与理论,色谱分离过程：,被分离的各组分受到固定相的作用力不同（吸附、分配、分子间氢键结合力等）；,在流动相与固定相发生相对移动过程中，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生作用的能力不同，在两相中的分配不同；,色谱分离技术的原理：,色谱分离过程：,与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞越小，向前移动的速度快，反之，与固定相相互作用力越强的组分，向前移动的速度越慢；,进行分部收集流出液，即可得到各单一组分，达到分离目的。,色谱分离技术的原理：,固定相,流动相,色谱柱,被分离组分,是色谱分离过程的一个,固定介质。,可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离,子交换剂等），,也可以是液体物质（如固定在硅胶、纤,维素或树脂上的溶液），,这些基质能与待分离的化合物进行,可逆,的吸附、分配、溶解、交换等作用；,它对色谱分离的效果起着关键的作用。,1. 固定相,在层析过程中，,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界流体等,都称为流动相。,柱层析中一般称为洗脱剂，,薄层层析称为展层剂。,它是层析分离中的重要影响因素之一。,2. 流动相,保留时间,待分离物质,从进样开始到组分,流出浓度最大,时所经过的时间,，称为该组分的色谱保留时间，用,t,R,表示。,保留体积,待分离物质,从进样开始到组分流出浓度最大时,所用洗脱液的体积,，称为该组分的保留体积，用,v,R,表示。,3. 保留时间和保留体,积,死时间,非保留溶质从进样开始到流出色谱柱所经历的时间，称为死时间；用,t,0,表示；,死体积,非保留溶质从进样开始到流出色谱柱所用的洗脱液的体积，称为死体积；用,v,0,表示。,4.死时间和死体积,调整保留时间,某种物质扣除死时间后的在色谱柱上的保留时间称为该物质的调整保留时间；,调整保留体积,某种物质扣除死体积后的在色谱柱上洗脱所用的洗脱剂的体积称为该物质的调整保留体积。,5.调整保留时间和调整保留时间,6.容量因子,表示某一溶质在色谱柱中任意位置达到平衡后，该溶质在固定相中量和在流动相中的量之比。,7.塔板理论,色谱柱的理论塔板数越大，塔板高度越小，色谱柱的分离效率越高。,8.分配系数,在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，,常用,K,表示,。,9.迁移率,（比移值） 在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用,R,f,表示。,10.分辨率,（分离度）,11.操作容量,（交换容量）,在一定条件下，某种组分与固定相反应达到平衡时，存在固定相上的饱和容量。,操作容量大，与固定相的亲和力越大，加入样量可越大。反之，相反。,正相色谱：,是指固定相的极性高于流动相,在层析过程中，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中洗脱出。,12. 正相色谱和反相色谱,反相色谱：,是指固定相的极性低于流动相,在层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快，而先从柱中洗脱流出。,12. 正相色谱和反相色谱,根据不同的标准可以分为多类：,A.根据固定相基质的形式分类：,纸层析：,以滤纸为基质；,薄层层析：,是将基质在玻璃或塑料等光滑表面,铺成一薄层，在薄层上进行层析；,柱层析：,将基质填装在管中形成柱形，在柱,中进行层析。,13. 层析法的分类,B.根据流动相的形式分类：,液相层析：,流动相为液体的层析；,气相层析：,流动相为气体的层析；,13. 层析法的分类,吸附层析：,以吸附剂为固定相，根据,待分离物与吸附剂之间的吸附力不同,达到分离目的；,分配层析：,是根据在一个由两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的,分配系数不同,而达到分离目的；,C. 根据分离原理的不同分类：,凝胶过滤层析：,以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据,物质的分子大小进行分离,的一种层析方法；,离子交换层析：,以离子交换剂为固定相，根据,物质的带电性质不同,而进行分离的一种层析方法；,C. 根据分离原理的不同分类：,亲和层析：,根据,生物大分子和配体之间的特异性亲 和力,，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析分离。,C. 根据分离原理的不同分类：,色谱法,液相色谱法,气相色谱法,平板色谱法,柱色谱法,纸,色,谱,法,气,液,色,谱,法,气,固,色,谱,法,分,配,色,谱,法,吸,附,色,谱,法,离,子,交,换,色,谱,法,排,阻,色,谱,法,超临界流体色谱法,亲,和,色,谱,法,薄,层,色,谱,法,二、吸附色谱法,(adsorption chromatography),1.原理：,吸附色谱为色谱固定相与流动相在,相对移动过程中，溶质和溶剂分子,在吸附剂表面上的活性位点相互竞,争的吸附过程。,简单的说,:依据吸附剂对混合物中各成分吸附,性能的不同，使各成分得到分离。,在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固-液吸附用得最多.,2.常用吸附剂：,硅胶、,氧化铝、,活性炭、,聚酰胺.,3.固-液吸附可分为:,物理吸附(表面吸附)：,硅胶、氧化铝及活性炭,化学吸附,半化学吸附：,聚酰胺层析,4.物理吸附的特点：,无选择性; 吸附与解吸是可逆的;,速度快; 实际应用最多。,5.化学吸附的特点：, 具有选择性；, 吸附十分牢固,有时甚至是不可逆的。, 化学吸附用得少.,6.半化学吸附的特点：, 介于物理吸附与化学吸附之间的吸附过程，其吸附力较弱。, 半化学吸附有一定应用价值。,如:,聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附属于半化学吸附。,液-固物理吸附色谱是运用较多的一种方法，,特别适用于很多,中等分子量的样品,（,分子量小于1000的低挥发性样品,）的分离，,尤其是脂溶性成分。,一般不适用于高分子量样品,如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等的分离。,吸附色谱的分离效果，决定于,吸附剂、,溶剂、,被分离化合物的性质这三个因素。,（一）吸附色谱分离中常用的固定相,1.氧化铝：,是由氢氧化铝直接在高温下脱水制得,因在制备方法和处理方法的差别有,碱性,中性,酸性,（一）吸附色谱分离中常用的固定相,碱性氧化铝pH9-10：,适合分离碱性和中性成分，,如生物碱；,中性氧化铝pH7.5：,适合生物碱、挥发油、萜类、,甾体等化合物；,酸性氧化铝pH4-5：,适合酸性物质，如酸性色素、,某些氨基酸等；,氧化铝的吸附机理：,表面上有铝醇基（Al-OH）羟基的氢键作用而吸附化学物质。,氧化铝的活性与含水量密切相关：,活化：,在高温下去除水分，含水量低，,活性增强，称为活化；,去活化：,加入一定量的水，含水量高，,活性降低，称为去活化。,a.,硅胶，通常用,SiO,2, xH,2,O,表示，是一种坚硬、无定型链状和网状结构的硅酸聚合物颗粒，约90的分离工作都可选用硅胶作为吸附剂。,2. 硅胶,b.,具有硅氧交联的结构，表面有许多的,硅醇基,的多孔性,微粒。,硅醇基是硅胶具有吸附能力的活性基团。,c.,被分离物质由于,极性和不饱和程度不同和硅醇基相互作用的程度不同,而达到分离目的。,2. 硅胶,d.,硅胶的羟基存在于硅胶表面较小的空穴中，因此,空穴较小而比表面积大的硅胶吸附性能力强。,水能与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇基而使得硅胶失去活性；,若将硅胶加热到,100左右加热，水能可逆地除去。,活化：,将硅胶在100左右加热，可去除部分水分，增强吸附能力。,一般指将硅胶,在110加热30min，增强吸附能力，称为活化。,湿法装柱法：,即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比一般为1:(20-30)。,硅胶最好一次倾入，,否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一、使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离结果。,e. 硅胶层析的装柱：,干法装柱：,将所需硅胶一次性全部倾入柱中，然后紧至硅胶高度不再变化即可。,欲分离样品与吸附剂的比例为1,:(30-60),e. 硅胶层析的装柱：,湿式加样：,把样品溶解在少量低极性溶剂中，,倾入柱顶后，样品均匀地吸附在吸附剂的表面，,然后用不同的溶剂作洗脱展开。,样品上柱？,湿式加样：,*切忌,以强极性溶剂或非均相的悬浊体系样品直接加入注中，这将导致分离实验的失败。,样品上柱？,干式加样:,将样品选择适宜的溶剂溶解，,并加入适量的吸附剂充分搅拌均匀，溶剂挥发尽，,加适量的流动相拌匀再上柱或直接加到柱顶。,一般可保持较高的柱效率和实验重现性。,样品上柱？,f.,硅胶是一种酸性吸附剂，,适用于中性或酸性成分的层析，,如酚类、甾体和萜类等。,分离效率与其粒度、孔径、和表面积有关,粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；,硅胶表面积越大，与样品之间的相互作用,越强，吸附力越强,同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，,当遇到较强的碱性化合物，,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。,3.活性炭,a.,是一种非极性吸附剂。具有非极性的表面,b.活性炭主要用于分离水溶性成分,，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。,3.活性炭,c.活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，,对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。,吸附力不容易控制，也没有测定级别的理想方法，,应用受到限制。,4.聚酰胺,a.,聚酰胺是由有机酸和有机胺经聚而成的高分子材料，俗称尼龙、锦纶。吸附属于氢键吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，,极性物质和非极性物质都适用。,b.,它的化学性质很稳定，,除了在浓HCl，热甲酸和苯酚等溶剂中可溶解外，不溶于水、醉、丙酮、氯仿、苯、正己烷等各种极性的与非极性的溶剂中。,聚酰胺的色谱分离机理比较复杂。链状的聚酰胺分子上有许多酰胺基团，形成活性中心。,在非水体系溶剂中它和弱极性分子相互作用，主要表现出吸附色谱的性能，溶剂的洗脱能力从极性小到大而递增。,c.分离机理：,但是在极性溶剂和水溶液中，由于酰胺基能与酸、酮、酮、醇、酚及胺等化合物生成氢键，,因此对这类化合物，以生成氢键能力的强弱而实现选择性的分离。,c.分离机理：,由于聚酰胺对物质的分离机理与硅胶等吸附色谱法不同，所选用的展开剂与洗脱剂也不相同。,它对水溶液中样品的吸附能力最大，即水是洗脱能力最差的溶剂；有机溶剂醇、丙酮和碱性溶液、甲酰胺等，使酰胺分子生成氢键的能力减弱，所以其洗脱能力强。,溶剂洗脱能力的顺序是：,水乙醇甲醇丙酮稀碱 (NH,4,OH)溶液甲酰胺DMF,由于在水溶液中，对极性有机物的吸附能力强，恰好利用此性质，可对水中微量强极性有机物进行吸附、富集和分离。,聚酰胺色谱的应用,聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的（鞣质除外），分离效果好，,加以吸附容量又大，,故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离,。,聚酰胺色谱的应用,对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有广泛的用途。,聚酰胺色谱的应用,因为,对鞣质的吸附特强，,近乎不可逆，故用于植物粗提取物的,脱鞣质处理特别适宜。,聚酰胺色谱有薄层色谱和柱色谱两种方式。,（二）吸附层析固定相的选择,固定相选择的原则：,主要依据,被分离对象的性质,、,分离的目的、,固定相的性质,决定。,样品的溶解性,：,一般情况下，,水溶解样品如糖类等，采用活性炭分离；,黄酮类主要用聚酰胺分离；,绝大多数有机化合物用硅胶和氧化铝作为固定相分离。,被分离对象的考虑因素包括：,样品的酸碱性,：,硅胶略带酸性，适用中性和酸性物质分离；碱性物质与硅胶作用，易被吸附，分离效果差。,氧化铝略带碱性，适用碱性和中性物质分离；酸性物质与其吸附较牢，分离效果差。,被分离对象的考虑因素包括：,化合物的极性,化合物的极性取决于其分子中的官能团的极性和分子结构，物质的结构不同，其极性不同。,通常极性大的物质吸附能力强，应根据化合物极性的不同选择不同的分离介质进行分离。,被分离对象的考虑因素,：,官能团的极性强弱,官能团,极性,R-COOH,大,Ar-OH,R-OH,R-NH,2,R-NH-R,R-N-R,2,R-CO-NR,2,R-CHO,R-CO-R,R-CO-OR,R-O-R,小,吸附剂对组分的作用,：,选用的,固定相必须和待分离对象不发生化学反应或不对被吸附分离的物质有破坏作用。,如，酸性的硅胶不适合分离碱性物质；碱性氧化铝不能用来分离酸性的酚类物质和黄酮类化合物等。,被分离对象的考虑因素,：,（三）吸附层析流动相的选择,在吸附柱层析分离中的流动相，在薄层层析中的展开剂，由单一或混合溶剂构成。,吸附层析过程实际上是组分分子与流动相分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。,（三）吸附层析流动相的选择,所用流动相的选择应同时考虑,被分离物质的性质、,吸附剂的活性、,展开剂的极性三个因素。,（三）吸附层析流动相的选择,分离,极性较强的组分时,：,选用吸附剂活性较低的吸附剂，,以,极性较强的流动相洗脱；,分离,极性较弱的组分时,：,选用吸附剂活性较高的吸附剂，,以,极性较弱的流动相洗脱。,易挥发，,毒性小的溶剂，,以便于除去溶剂，回收样品。,同时必须注意溶剂对样品中的各种组分以及与吸附剂之间不发生化学反应。,洗脱液中各馏分的监测一般采用间断式定体积收集流出掖，控制流速1-3滴/秒。,流动溶剂应尽量选择：,以吸附原理为主的,硅胶柱，,流动相的选择，,一般按溶剂的极性由小到大顺序加入,。,常用的有机溶剂极性由小到大的顺序排列：,正己烷石油醚环己烷四氯化碳苯甲苯氯仿乙醚乙酸乙醋丙酮,乙醇甲醇水乙酸甲酸。,（四）吸附层析操作技术,按其操作方式分为：,柱层析,薄层层析,经典的柱层析法：由于样品容量大，主要用于天然产物的制备分离；,薄层层析：更适用于分离分析或少量样品的分离制备。,（四）吸附层析操作技术,柱层析：,将作为固定相的吸附剂装在一根层析柱中，从管顶加入流动相。,使流动相由上往下流过而使各种成分分离并依次流出层析柱的过程称为洗脱。,在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液进行检查。,柱层析的基本操作:,(1)装柱,装柱的要求：,柱子装得均匀，不能分层，不能有气泡等,否则要重新装柱；,柱子的选择：,柱子的直径和分离目的而定。,一般柱子的直径:长度约为1,:(10-50);,且洗涤干净；,装柱过程：,关闭层析柱出水口，,装入1/3柱高的溶剂作缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢倒入柱中，使其沉降约3cm高。,打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液（吸附剂的多少根据样品的多少而定）。,注意：,不可干柱、分层，否则需要重新装柱。,柱层析的基本操作:,(2)平衡,柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。,方法：用恒流泵在恒定压力下走柱子,（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。,柱层析的基本操作:,(3)加样,加样量的多少直接影响分离的效果。,加样量应,少于20的操作容量，,体积应,低于5的床体积，,对于分析柱层析，一般不超过床体积的,1,。,加样时应缓慢小心将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保证基质表面平坦。,柱层析的基本操作,(4)洗脱,【洗脱时切勿使溶剂流干！】,洗脱的方式分为：,简单洗脱、,分步洗脱、,梯度洗脱。,柱层析的基本操作,简单洗脱：,始终是用,同样的一种溶剂洗脱,，直到层析分离过程结束。,适合,被分离物质对固定相的亲和力差异不大，,区带的洗脱时间间隔不长,。,柱层析的基本操作,分步洗脱：,按照,递增洗脱能力顺序排列,的几种洗脱液，,进行逐级洗脱,。,适合,混合物组成简单，各组分性质差异较大或需快速分离。,柱层析的基本操作,梯度洗脱：,洗脱能力是,逐步连续增加的,，,梯度可是浓度、极性、离子强度和pH等,最常用的是浓度梯度。,混合物中各组分复杂且性质差异较小时,可用。,柱层析的基本操作:,(5)收集、鉴定及保存,由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。,每管的收集量不能太多，一般5ml左右；,如分离的物质性质相似，收集更少量/管。,在合并一个峰的各管溶液之前，,还要进行鉴定。,柱层析的基本操作:,(6)基质的再生,许多基质可用反复使用多次，,可回收处理后再用，,各种基质的再生方法都有各自的方法，,根据不同的处理方法处理基质再生。,如：聚酰胺柱的再生,待样品中各组分从柱中洗脱后，,再进一步用甲醇：氨水(1:1)充分洗涤柱子，将柱中吸附残留的样品全部解吸；,再换用pH3-4的HCl水溶液通过柱子，,使聚酰胺恢复原有的活性，重复使用。,如：聚酰胺柱的再生,在以制备分离为目的的实验中，,调节溶液的PH值尽量采用稀NaOH和HCl，以免样品中引进其他的阳离子和阴离子，对样品的红外图谱产生干扰。,如用NH,4,OH溶液调节pH时，在样品中引入了NH,4,离子，在红外图1400cm-1处会出现一尖锐的强蜂，干扰了样品的红外图谱。,（五）吸附薄层层析,薄层层析：简便、快速、微量的层析方法。,一般将,吸附剂涂布到平面,如玻璃片上，,形成,一,薄层固定相,，,在一个以展开剂饱和的密闭容器内，,展开剂依靠固定相的毛细作用和固定相作相对移动，使物质发生分离,；,这种方法称薄层层析。,（五）吸附薄层层析,薄层层析用的吸附剂与其选择原则：,和柱层析相同，,主要区别在于：薄层层析要求吸附剂的,粒度更细,，一般应小于10um，,粒度均匀,用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般,活度要求不宜过高,，以IIIII级为宜。,（五）吸附薄层层析,薄层层析用的展开剂：,展开距离随薄层的粒度粗细而定；,粒度越细，展开距离相应缩短；,一般不超过10cm，否则影响分离效果；,（五）吸附薄层层析,薄层层析用的展开剂：,当吸附剂的活度一定时，多组分样品的分离取决于展开剂的选择。,中草药化学成分在脂溶性成分中大致分为：无极性、弱极性、中极性与强极性,薄层层析,特殊薄层,对于某些性质特殊的化合物的分离与检出，需要采用一些特殊薄层,包括：,荧光薄层, 络合薄层, 酸碱薄层和PH缓冲薄层, 荧光薄层,原因：,有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂；, 荧光薄层,处理：,可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。,展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。, 荧光薄层,常用的荧光物质多为无机物。,其一是,在,254nm紫外光激发下,显出荧光的，,如锰激化的硅酸锌。,另一种为,在365nm紫外光激发下,发出荧光,如银激化的硫化锌、硫化锆。, 络合薄层,常用的有硝酸银薄层，,用来,分离碳原子数相等而其中C=C双键数目不等的一系列化合物，,如不饱和醇、酸等。, 络合薄层,其主要机理,由于,C=C键能与硝酸银形成络合物,，,而,饱和的C-C键则不与硝酸银络合,。,因此在硝酸银薄层上，化合物可由于饱和程度不同而获得分离。, 络合薄层,层析时：,饱和化合物由于吸附最弱而R,f,最高，,含一个双键的较含两个双键的R,f,值高，,含一个三键的较含一个双键的R,f,值高。,在一个双键化合物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。,因此，还可用来分离顺反异构体。, 酸碱薄层和pH缓冲薄层,改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。,如,硅胶带微酸性,：,有时对碱性物质如生物碱的分离不好，,如不能展层或拖尾,可在铺薄层时，用稀碱溶液0.10.5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层。,（4）薄层层析法应用, 化学成分的预试, 化学成分的鉴定, 探索柱层分离的条件, 化学成分的预试,用薄层层析法进行中草药化学成分预试，,可依据各类成分性质及熟知的条件，,有针对性地进行。,由于在薄层上展层后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠。, 化学成分的鉴定,以薄层层析法进中草药化学成分鉴定，最好,要有标准样品进行共薄层层析,。,如用数种溶剂展层后，标准品和鉴定品的,R,f,值、斑点形状颜色都完全相同,，则可作初步结论是同一化合物。,但,一般需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对,。, 探索柱层分离的条件,在进行柱层分离时：,首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。,在洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱，,每一洗脱液中是否为单一成分或混合体，, 探索柱层分离的条件,均可由薄层的分离得到判断与检验。,通过薄层的预分离，还可以了解多组分样品的组成与相对含量。,如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，,即可将此条件用于干柱层析。,中药的薄层色谱分析,组分移动的位置,溶剂前沿,R,A,R,x,A,R,f,= R,A,/R,x,B,C,D,Rf值的范围为0.35Rf0.15时，可达到分离目的,（5）制备薄层色谱 PTLC,一种是流动相靠毛细管作用力流经固定相,（,传统的制备型薄层薄层色谱,）,另一些方法是流动相靠外力强制流动，,如离心薄层色谱和加压薄层色谱。,（5）制备薄层色谱 PTLC,吸附剂:,硅胶,是最常用的吸附剂。,上样量与吸附剂的厚度有关。,（5）制备薄层色谱 PTLC,上样:,是进行PTLC分离的一个最关键的步骤。,上样前先用样品溶于少量溶剂，,低挥发性溶剂可引起点样带变宽，,最好选用挥发性溶剂,（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）,样品浓度应,在5%-10%左右。,点样带尽可能狭窄，以获得更好的分离效果,点样可用手工进行或自动点样仪。,展开剂的选择及展开:,在进行,PTLC之前应用分析型TLC预,试验来确定展开剂。,被分离物质的回收：,用合适溶剂溶解样品，浓缩即可。,（六）大孔吸附树脂,大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，具有较好的吸附性能。它的,吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键。,大孔树脂吸附分离技术是采用特殊的吸附剂，,选择地吸附其中的有效成分，去除无效成分的一种提取精制的新工艺。, 大孔吸附树脂的性质,大孔吸附树脂多为白色的球状颗粒粒度多为20-60目，通常分为,非极性、中性和极性,三大类，根据极性大小还可分为,弱极性、中等极性和强极性,。,常用的为苯乙烯型和丙烯腈型，在树脂合成时,根据需要引入极性基团则成为极性树脂从而增强吸附能力。, 大孔吸附树脂的性质,优点：,大孔吸附树脂的,理化性质稳定，,不溶于酸、碱及有机溶剂,。,对有机物的,选择性较好,，,不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响。, 大孔吸附树脂的分离原理,吸附性,范德华引力或生成氢键的结果。,筛选原理,本身多孔性结构所决定。,由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上经一定的溶剂洗脱而分开。, 大孔吸附树脂的分离原理,a. 有机物与无机物的分离,一般的吸附树脂对溶液中的无机离子没有任何吸附能力，在吸附混合物时，有机物被树脂吸附，无机离子则随水流出，因而很容易将二者分离。,在中药成分的提取中，此特征使提取物中的重金属和灼烧灰分降至要求的范围内。,b. 解离物与非解离物的分离,吸附树脂对有机解离物与非解离物的吸附能力有很大差异。因此，可将二者分离。,如,有机酸在高pH值成盐,，很难被吸附，,因此在碱性条件下可把有机酸分离出来。,生物碱在酸性介质中可以成盐，,因而能通过调节pH值进行分离。,一般有机物，包括大多数中药有效成分，有一定的水溶性，但溶解度不大的物质，这些物质容易被树脂吸附。,强水溶性物质如低级醇类、低级胺类、糖及多糖、多数氨基酸、肽类、蛋白质等，难被普通吸附树脂吸附。,用普通树脂可很容易地将此两类物质分离。,C. 一般有机物与强水溶性物质的分离,（3）大孔吸附树脂分离条件的确立,1、树脂的选择,首先，要根据被分离化合物的分子体积的大小通过预实验确定适当孔径的树脂。,其次，要根据分子中是否含有酚羟基、羧基或碱性氮原子来确定树脂的型号和分离条件。,2、洗脱液的选择,对非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。,对中等极性大孔树脂和极性较大的化合物来说，则用极性较大的洗脱剂为佳。,根据吸附力强弱选用不同的洗脱剂及浓度。为达到满意的效果，可通过几种洗脱剂浓度的比较来确定最佳洗脱浓度。,实际工作中甲醇、乙醇、丙酮应用较多。, 在中药生产中应用的优点,1、缩小剂量，提高制剂的内在质量,大孔吸附树脂处理减少提取物中的杂质,提高效成分的含量，,使制剂剂量减小，,有利于制成现代剂型的中药制剂，,并便于质量控制。,2、减小产品的吸湿性,传统的提取方法所提的中成药大部分具有较强的吸潮性，是中药生产及储藏中长期存在的问题。,而经大孔吸附树脂处理可有效去除吸潮成分，增强产品的稳定性。,3、有效去除重金属,既保证了患者的用药安全，,同时也解决了中药重金属超标的难题，,为中药进入国际市场创造了条件。,活性成分的提取分离,皂甙（人参总皂甙、蒺藜总皂昔）、,黄酮（葛根总黄酮、山楂总黄酮等）、,内酯类,生物碱等化合物；, 大孔吸附树脂在中药生产中的应用, 大孔吸附树脂的处理,市售大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体、致孔剂（多为长碳链的脂肪醇类）、,分散剂和防腐剂等杂质，使用前必须经过处理。, 大孔吸附树脂的处理,处理方法是：,采用乙醇湿法装柱，,随用乙醇在柱上作流动清洗，,并不时检查流出的乙醇，,直至流出的乙醇液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，,然后用大量蒸馏水洗去乙醇。, 大孔吸附树脂柱色谱,样品,一般用水溶液上柱,。,洗脱时根据吸附作用强弱不同，选用不同浓度的甲醇、乙醇等含水溶剂，直至纯的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。,对非极性大孔吸附树脂，洗脱溶剂极性越小，洗脱能力越强。,对于中等极性的大孔吸附树脂和极性较大的化合物来说，则以用极性较大的溶剂为宜。,根据物质分子大小差异进行分离,天然有机化合物分子大小各异，,中药的化学成分非常复杂，通常含有无机盐、生物碱、氨基酸和有机酸、酚类、酮类、皂昔、甾族和萜类化合物以及蛋白质、多糖、粘液质、鞣质、淀粉、纤维素、无机盐等。,相对分子质量的分布很宽，从几十到几百万道尔顿。故可据此进行分离。,下表列出部分中药所含主要成分的相对分子质量范围。,部分中药主要成分的相对分子质量,三、分配色谱,(partition chromatography),三、分配色谱,(partition chromatography),分配色谱是,利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。,分配色谱中，通常采用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可以沿固定相流动，称为流动相,。,三、分配色谱,(partition chromatography),当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配，由于各物质有不同的分配系数，移动速率也就不相同，从而达到,分离的目的。,三、分配色谱,(partition chromatography),分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在色谱条件确定后分配系数是一常数，,以,K,表示。,分配色谱法,按照固定相与流动相的极性差别分为:,正相色谱法,反相色谱法,正相色谱法：,在正相分配色谱法中，,流动相的极性小于固定相极性。,常用的固定相有氰基与氨基键合相，,主要用于分离极性及中等极性的分子型物质。,反相色谱法,：在反相分配色谱法中，,流动相的极性大于固定相极性。,常用的固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C,8,键合相。,流动相常用甲醇-水或乙腈-水。,主要用于分离,非极性及中等极性的各类分子型化合物,。中药中的各种苷类特别适合用反相色谱法分离。,2、反相分配色谱,(reverse phase partition chromatography),（1）固定相：石蜡油等弱极性有机溶剂。,（2）流动相：水、甲醇等强极性有机溶剂,（3）应用：,适合于分离脂溶性化合物，,如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。,亲油性表面,亲水性表面,硅胶,化学修饰,反相色谱是应用最广的色谱法，,因为键合相表面的官能团不会流失，流动相的极性可以在很大的范围调整，再加之由它派生的反相离子对色谱法和离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。,高效液相色谱（HPLC）最常用的即是反相填料。,
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