新人教版生物选修1课题2《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教案二

2019 最新新人教版生物选修1 课题 2多聚酶链式反应扩增 DNA片段教案二【课题目标】本课题通过尝试 PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作 , 使学生体验 PCR这一常规的分子生物学实验方法 , 理解 PCR的原理 , 讨论 PCR的应用。【课题重点与难点】课题重点： PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点： PCR的原理。导学诱思 1PCR原理填写下列表格参与的组分在 DNA 复制中的作用解旋酶DNA 母链合成子链的原料DNA 聚合酶引物DNA 的两条链是反向平行的 ,通常将 DNA 的羟基末端称为,而磷酸基团的末端称为。DNA 聚合酶不能开始合成 DNA,而只能,因此 ,DNA 复制需要引物。 DNA 的合成方向总是。在 DNA 的复制过程中 ,复制的前提是。在体外可通过控制来实现。在的温度范围内 ,DNA 的双螺旋结构将解体,双链分开 ,这个过程称为。 PCR利用了 DNA 的原理 ,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高 ,导致DNA 聚合酶失活 ,后来的 DNA 聚合酶的发现和应用,大大增加了 PCR的效率。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：,同,时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。2PCR的反应过程PCR一般要经历循环 ,每次循环可以分为、和三步。从第二轮循环开始 ,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由延伸而成的 DNA 单链会与结合 ,进行 DNA 的延伸 ,这样 ,DNA 聚合酶只能使,这段固定长度的序列成指数扩增。3实验操作在实验室中 ,做 PCR通常使用, 它是一种薄壁塑料管。具体操作时,用微量移液器 ,按 PCR反应体系的配方在中依次加入各组分,再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。4操作提示为避免外源 DNA 等因素的污染 ,PCR实验中使用的、以及蒸馏水等在使1 / 4用前必须进行。 PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时 ,移液管上的枪头要。疑难点拨 1.PCR技术简介PCR是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术 ,它能以极少量的DNA 为模板 ,在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA 含量太低而难以对样品进行分析研究的问题,被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和 DNA 序列测定等各方面。2细胞内参与 DNA 复制的各种组成成分及其作用解旋酶：打开DNA 双链DNA 母链：提供 DNA 复制的模板 4 种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA 聚合酶：催化合成DNA 子链引物：使 DNA 聚合酶能够从引物的 3,端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA 或 RNA,它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对。用于 PCR的引物长度通常为2030 个核苷酸）3DNA 的合成方向3,端 ,而磷酸基团的末端称为DNA 的两条链是反向平行的 ,通常将 DNA 的羟基末端称为5,端。 DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从 3,端延伸 DNA 链 ,因此 ,DNA 复制需要引物。当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后,DNA 聚合酶就能从引物的3,端开始延伸DNA 链,DNA 的合成方向总是从子链的5,端向 3,端延伸。4PCR的反应过程90oC 以上时 ,双PCR 一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性（当温度上升到链 DNA 解聚为单链）、复性（温度下降到50o C 左右 , 两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合）和延伸（温度上升到72oC 左右 ,溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA 聚合酶的作用下 ,根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链）三步。从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物延伸而成的DNA 单链会与引物结合,进行 DNA 的延伸,这样 ,DNA 聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA 序列 ,使这段固定长度的序列成指数扩增。5PCR技术与 DNA 的复制PCR反应是通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行。 PCR反应的实质就是DNA 复制 ,所以有关 PCR 反应的题目与DNA 复制的原理相同 ,计算方法也大体相同。例如：PCR 反应中的目的片段一般以 2n 的方式积累 ,其中 n 为反应循环次数。一个DNA 片段在30 次循环后反应物中大约有10 亿个这样的片段。（23 0）典例解析 一个由 15N 标记的 DNA 分子 ,放在没有标记的环境中培养,利用 PCR循环 5次后标记的 DNA分子总数的（）A 1/ 10 B 1/5C /16 D1/25答案： C5 次后产生的 DNA 分子数目为 2 n。而 DNA 的复制解析：一个 DNA 分子利用 PCR技术循环是半保留复制 ,其特点是：新形成的DNA 双链 ,一条是来自亲代 DNA 分子的母链 ,另一条是新形成的子链。这样最初由15N 标记的 DNA 分子复制后 ,其标记的两条链就分别进入两个子代DNA 分子中 ,这样两个子代DNA 分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养,不论经过多少次复制 ,最初标记的两条链始终存在于两个DNA 分子中 ,这样经过 n 次循环后 ,标记的DNA 分子中 2/2n,即 1/2n-1。【课本问题答案 和提示】2 / 4练习1. 提示：绘图可参考教科书中图5-9 。 PCR反应中的目的片段一般以2n 的方式积累 ,其中 n 为反应循环次数。一个 DNA片段在 30 次循环后反应物中大约有 10 亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824) 。2. 提示： PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验, 感兴趣的学生可以参考分子克隆实验指南（ 见本专题参考书目） , 书中有详尽的论述。【参考资料】1. 琼脂糖凝胶浓度与 DNA分离范围的关系凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA 的 DNA片段大小约为1 500 个核苷酸的长度 , 因此根据表4-1 选用 1（ 1 g/100 mL, 下同）的凝胶浓度。表 4-1 琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范 围的关系琼脂糖凝胶浓度 (%)线型 DNA分子的分离范围 ( 千碱基对 ,kb)0.35600.61200.70.8 100.90.5 71.20.9 61.50.2 312.00. 1 22. 核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种, 分别是Tris 硼酸 (TBE) 、 Tris 乙酸 (TAE) 和 Tris 磷酸(TPE) 。在上述三种缓冲液中：TBE与 TPE缓冲液容量高, 对 DNA的分离效果好, 但 TPE液中含磷酸盐的浓度偏高, 容易使DNA 沉淀。 TAE 液的缓冲容量低, 价格较便宜。本实验选用的是 TBE缓冲液。缓冲液中的 EDTA可螯合正价阳离子 , 从而抑制 DNA酶的活性 , 防止 PCR产物被降解。10 倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。Tris108 gEDTA 9.3 g硼酸55 g3 / 4将上述物质溶解后, 用蒸馏水定容至1 000 mL, 调节 pH 为 8.0 8.2 备用 , 使用时需稀释 10 倍。3. 核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝, 溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：能够增加样品密度, 确保DNA 均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带, 从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色, 使加样操作更方便。核酸电泳后 , 需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭 (EB) 是一种荧光染料 , 有剧毒 , 因此操作时要非常小心。EB 可嵌入 DNA双链的碱基对之间 , 在紫外线激发下 , 能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入 EB,使其终浓度为0.5 g/mL；一种是在电泳后 , 将凝胶浸入 0.5 g/mL 的 EB 溶液中 , 染色 10 15 min 。当凝胶染色过深时, 可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30 min后再观察。4.PCR 的常见问题PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时, 应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA 聚合酶 , 并增加 5 10 次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用 Taq DNA聚合酶时 , 要注意用活力高、质量好的酶。同时, 在提取 DNA模板时 , 应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物, 如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA 聚合酶对模板纯度的要求不高, 但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况 , 尤其需要保证引物的3 端与靶基因互补。PCR 技术高度灵敏 , 极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增 , 因此模板DNA的污染是 PCR假阳性结果的主要原因。此外, 样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR 操作时要注意做到：隔离操作区,分装试剂 , 简化操作程序 , 使用一次性吸头等【教学反思】4 / 4