显微操作技术 荧光显微镜技术的特点和应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,荧光显微镜技术的特点和应用,荧光显微镜的种类,透射式,落射式,和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点,:,(1),荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的波长短,1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传统显微镜的分辨率的极限,(2),荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性,.,它所用染料的量是极其微小的,只相当于传统显微技术中染料消耗量的几千分之一,.,(3),荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成分,并且显示的彩色效果很明亮,极易观察,极易进行定量分析,而且能以极低浓度的染料检测出含量极微的物质,.,(4),随着新的荧光染料的发明,可不断扩大被测物质的范围,.,生物学材料，有各种产生荧光,:,1.,自发荧光,:,或原发荧光,细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生荧光,2.,诱发荧光,材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为荧光色团。戊二醛也能诱发荧光,3,荧光染料染色：,应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。许多常规染色剂,(,如刚果红、曙红、碱性品红、水溶性苯胺蓝等,),兼有荧光染料的性能,1.DNA,研究,用细胞荧光测定技术测量,DNA,是荧光显微技术和细胞光度技术相结合的产物,标志着前者由定性向定量测定发展,.,吖啶橙,3,，,6,（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式,C17H19N3 ,HCl,ZnCl,分子量,438.12g/mol,是一种荧光,色素,，其检测激发滤光片波长,488nm,阻断,滤光片,波长,515nm,。,吖啶橙,染色原理,:,吖啶橙可对细胞中的,DNA,和,RNA,同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为,492nm,，荧光发射峰为,530nm,（,DNA,）、,640,（,RNA,），它与双链,DNA,的结合方式是嵌入双链之间，而与单链,DNA,和,RNA,则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（,502nm,）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约,530nm,），胞质,RNA,发橘红色荧光（,580nm,）。,它与,细胞,中,DNA,和,RNA,结合量存在差别，可发出不同颜色的,荧光,，与,DNA,结合量少发绿色荧光，与,RNA,结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核,DNA,和,RNA,染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。,体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色,可见含,DNA,的细胞核显示黄绿色荧光，含,RNA,的细胞质显示橘红色荧光,DAPI,DAPI,即,4,6-,二脒基,-2-,苯基吲哚,(4,6-diamidino-2-phenylindole),，是一种能够与,DNA,强力,结合的,荧光染料,，最大吸收波长为,358nm,，最大发射波长为,461nm,。,DAPI,染色原理：,DAPI,为一种,荧光染料,，可以穿透细胞膜与,细胞核,中的双链,DNA,结合而发挥标记的作用，可以产生比,DAPI,自身强,20,多倍的荧光，和,EB,相比，对双链,DNA,的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察,细胞标记,的效率高,(,几乎为,100 %),，且对活细胞无毒副作用。,2.,细胞壁研究,荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出方面,是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生,以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化,观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色或利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方法是荧光增白剂染色,在,4QOnm,左右的激发光照射下观察细胞壁,(,纤维素,),所产生的绿色荧光来判断细胞壁的有无,荧光增白剂染色,荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力,当前常用的荧光增白剂有,ST,M2R,VBL.ST,开始被用于显示细菌,放线菌与真菌的细胞壁,在粘菌材料中,它被证明与纤维素和几丁质有亲和力,胼胝质是一种以,-1,3,键结合的葡聚糖。在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的生长代谢过程。,胼胝质是一种以,-1,3,键结合的葡聚糖。在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的生长代谢过程。,3,细胞生活力测定,荧光素,双醋酸酯（,FDA,）是一种常用的培养动,植物细胞,以及,植物细胞,原生质体,的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：,FDA,本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当,FDA,进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质,荧光素,，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使,FDA,分解，而无法产生荧光,活体染色,vital staining,将无毒或毒性较小的某种染料注入动物体内,可被机体内某些组织或细胞所摄取,称为活体,.,影响荧光的因素,1. pH,的影响,带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液,PH,值有关，例如：在,pH=7-12,的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在,pH13,的溶液中苯胺以离子形式存在，都不会发出荧光。,同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。,2.,温度的影响,温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。,3.,荧光强度与溶液浓度的关系,在稀溶液中：,F,Kc,F,为荧光强度,K-,检测效率（由仪器决定）,c,为液体的浓度高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使,F,与,c,不呈线性关系,4,猝灭剂,何为猝灭,?,由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而降低了发光效率的现象叫做猝灭,在荧光物质溶液中,加入某种化合物,使溶液的荧光强度显著降低,这种化合物称为猝灭剂,猝灭作用可能是由于一部分荧光物质分子,M,与猝灭剂,Q,作用而生成了配合物,MQ,如配合物,MQ,的形成是由于微弱的范德华引力的作用,则所形成的配合物并不发生荧光,.,在这种情况下,荧光物质分子,M,和配合物,MQ,相对都吸收光,但配合物吸收光后不发生荧光,而将所吸收的光降解为热,唯有荧光物质,M,在吸收光之后发生荧光,因此猝灭剂的加入将使荧光强度大大降低,.,