《生化实验技术》综合设计性大实验

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生化实验技术,综合设计性大实验,1,合作性学习实验实施流程及要求,课堂理论学习：,辅导相关生化大分子提取分离纯化基本知识,项目发布：,了解项目内容,网上预约：,理论自学设计实验方案网上递交教师修改及审核实验室项目实施论文上交教师批阅评分,实验分组：,各自组合，最多不超过4人/组，推选组长，负责平时讨论、项目方案设计及材料收集,2,实验实施要求,：平时按各组计划时间分别进行实验，组长有义务指导下组相关实验内容，每次实验必须登记。,全班交流,：实验结束安排课堂讨论交流，每组准备一人汇报，一人记录；要求用PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难点，其他组学生质疑，教师点评。,指导教师,：汪财生、斯越秀,3,通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、DNA制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析；在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。,实验项目训练目标,4,思考题（课前设疑）,1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？,2.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？,3.在制备生化物质前应如何选择原料？,5,4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？,5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？,6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理？,6,7.干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转型？,8.动植物总DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以猪脾脏DNA提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所提取DNA的纯度？,9.蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量测定方法有哪些？,7,07级生物技术实验安排,11-14周 生物技术072-073班实验,14-16周 生物技术071班实验,15周 生物技术072-073班上交,论文及讨论材料等,17周 生物技术071班上交论文,及讨论材料等,8,第一部分,生化物质的制备分析,9,一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：,1.原料的选择和预处理,2.原料的粉碎；,3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗,品的工艺过程；,4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、,层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行,精制的工艺过程；,10,利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题：,6.成品及制剂,，即半成品或原料药经精细加工制成,片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。,5.干燥及保存,；,11,1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。,12,2在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有,1l0 000,，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比“,虎头蛇尾,”。近年来，用所谓“,钓鱼法,”，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的优越性。,13,3许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保护这些化合物生物的活性，常选择十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中，,过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体内自身酶的作用，均可破坏这些分子的结构或生理活性。,14,4生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、pH、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常无法固定，有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。因此，要建立重复性好的成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。,15,5生化制备方法最后,均一性,的证明与化学上,纯度,的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对“,均一性,”结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。,16,原料选择和预处理,选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几个方面:,1要选择有效成分含量高的新鲜材料；,2来源丰富易得；,3制造工艺简单易行；,4成本比较低；,5经济效果要好。,17,如蛋白质原料的选择,蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。,18,对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的,种属、,发育,阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞,都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。,19,1种属,牛胰含胰岛素（insulin)单位比猪胰高，牛为,4000 IUkg,胰脏，猪为,3000 IUkg,胰脏。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。,20,2发育生长阶段,幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。,21,3生物状态,动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO（erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。,22,4原料来源,血管舒缓素可分别从,猪胰脏和猪颚下腺,中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。,23,5原料解剖学部位,猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。,胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。,24,6.从简化提纯步骤着手,如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。,25,7,对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用,大肠杆菌,表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；,26,用,肿瘤细胞,作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。,用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用,动物细胞和昆虫细胞,表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。,27,原料的粉碎,在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。,28,不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。,如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。,29,主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（,10 000rmin,）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。,(,一)机械法,30,(二)物理法,1.反复冻融法,把待破碎的样品冷至,15,20,，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。,31,在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。,2.冷热交替法,32,3超声波处理法,多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50,100mgL菌体的浓度，在1KHz,10KHz（千赫兹）频率下处理10,15min。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。,33,4.压破碎法,加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达20.59,34,.32MPa,（,210,350kgfcm,2,）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。,34,(,三)生化及化学法,1自溶法,即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。,自溶的温度，动物材料选在0,4，微生物材料则多在室温下进行,。,35,自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。,36,2酶处理法,用外来酶处理生物材料，如,溶菌酶,（Lysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8的0.1molL三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.01molL乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保温10min，细菌胞壁即被破坏；还有把,蜗牛酶,用于酵母细胞的破碎；用,胰酶,处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有,纤维素酶,（破坏植物细胞）、,细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。,37,3.表面活性剂处理法,表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有,十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。,38,生化物质的提取,利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extraction），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。,用冷溶剂从固体态物质提取的过程可称为浸渍（maceration）；用热溶剂者可称为浸提（digestion），也称浸煮,39,一、物质的性质与提取,（一）物质的性质与提取方法的选择,选择合适的溶剂系统与提取条件。,（,二）活性物质的保护措施,1采用缓冲系统,2添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）,3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA),4其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌 ）,40,（三）生化物质的提取,一般生产上多用,2,3次,提取。溶剂用量（L）为生物材料的,2,5,倍，少数情况也有用,10,20,倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。,41,二、影响提取的因素,（）温度,（二）酸碱度,（三）盐浓度,42,三、提取方法,（一）用酸、碱、盐水溶液提取,（二）用表面活性剂提取,（三）有机溶剂提取,43,对,酸性,物质的提取，常在,碱性,条件下进行；对,碱性,物质的提取，常在,酸性,条件下进行；对,两性,物质的提取，则使水溶液的pH值在远离该两性物质的,等电点,为佳。,44,（三）超临界气体的萃取技术,以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。,45,气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有,二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷,等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。,46,该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如,鱼油和卵磷脂,的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。,47,四、提取液的分离,提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分离。溶液与固体的分离，一般处理方法有三种：,自然沉降、过滤、离心,。,自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程,。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等方法将液体部分移去。,48,过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程,。,离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作,，其中通过过滤介质分离液体和固体者为离心过滤；利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；,利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。,49,生化物质的分离纯化技术,生化物质分离纯化技术包括：,生化产品的分离分析和生化产品的制备,。,前者主要对生物体内各组份加以分离后进行定性、定量鉴定，它不一,定要把某组分从混合物中分离提取出来；而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。,50,为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“,多阶式,”方法进行，即常说的“,逐级分离,”方法。,为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。因此操作的时间长，手续繁琐，给制备工作带来众多影响。,51,亲和层析法,具有从复杂生物组成中专一的“钓出”特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。,52,（一）分离纯化原理,（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、 电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。,（2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。,53,（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。,（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。,（5）根据配体特异性进行分离亲和层析法。,54,（二）分离纯化的程序和生产设计,（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；,（2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；,（3）材料处理及抽提方法的选择；,（4）分离纯化方法的摸索；,（5）产物的均一性测定。,55,1分离纯化初期使用方法的选择,早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。,56,早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且,负荷量较大者为合适,，但随着许多新技术的建立，一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高，生化物质的变性危险愈少，因此亲和层析法，纤维素离子交换层析法、连续流动电泳、连续流动等电聚焦等在一定条件下，也用于从粗提取液中分离制备小量目的物。,57,2各种分离纯化方法的使用程序,生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。,例如纯化其一两性物质时，前一步已利用该物质的阴离子性质，使用了阴离子交换层析法，下一步提纯时再应用其阳离子性质作层析或电泳分离便会取得较好分离效果。,58,如有些杂质在各种条件下带电荷性质可能与目的物相似，其分子形状与大小与目的物相差较大，而另一些杂质的分子形状与大小可能与目的物相似，但在某条件下与目的物的电荷性质不同，在这种情况下，先用分子筛，用离心或膜过滤法除去分子量相差较大的杂质，然后在一定pH值和离子强度范围下，使目的物变成有利的离子状态，便能有效地进行层析分离。,59,在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。如倒过来进行，先吸附，后盐析就比较合理。,60,3分离后期的保护性措施,在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气的氧化和某些事先无法了解的因素。为了取得足够量的样品，常常需要加大原材料的用量，并在后期纯化工序中注意保持样品溶液有较高的浓度，以防制备物在稀溶液中的变性，有时常加入一些电解质以保护生化物质的活性，减少样品溶液在器皿中的残留量。,61,（三）分离纯化方法的评估,每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。一般经过5,6步提纯后，活力回收在25以上。但不同物质的稳定性不同、分离难易不同，回收率也不同。,62,对每一步骤方法的优劣的记录，体现在所得产品,重量及活性,平衡关系上。这一关系，可通过每一步骤的分析鉴定求出。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。其他活性物质也可通过测定总活性的变化与样品重量或体积与测出的活力列表进行对比分析，算出每步的提纯倍数及回收率。,63,（四）生化产品纯度的鉴定,一个制备物是否纯，常以“,均一性”,表示。,均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定,。有时某一种测定方法认为该物质是均一的，但另一种测定方法却可把它分成两个甚至更多的组分，这就说明前一种鉴定方法所得的结果是片面的。,64,如果某物质所具有的物理、化学等方面性质经过几种高灵敏度方法的鉴定都是均一的，那么大致可以认为它是均一的。当然，随着更好的鉴定方法的出现。还可能发现它不是均一的。绝对的标准只有把制备物的全部结构搞清楚，并经过人工合成证明具有相同生理活性时，才能肯定制备物是绝对纯净的。,65,生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的,有溶解度法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法,等。,66,第二部分,实验内容简介,67,猪血清,-,球蛋白分离纯化及鉴定,实验一、,68,蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学及其生物功能的重要手段。不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。,1.1 内容提要,69,免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人体接受抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。各种免疫球蛋白能特异地与相应的抗原结合形成抗原-抗体复合物（免疫复合物），从而阻断抗原对人体的有害作用，对细菌等抗原的杀伤最后由补体去完成。,70,-球蛋白也称为丙种球蛋白，相对分子量为15-16万，沉降系数为7S；是一组在结构与功能上有密切关系蛋白质。杨据Ig的免疫化学特性，可分为五大类：IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE，其分子不论哪一类，都由四链组成，即由两条相同的长多肽链称H链（又称重链）及两条相同的短肽链称L链（又称轻链）组成。,机体大部分免疫功能力都依赖于IgG类免疫球蛋白，它约占免疫球蛋白总量的70-90%。,71,IgG是人和动物血浆蛋白的重要组分之一，制备-球蛋白的原料通常用动物血液，其次还有动物胎盘和初乳乳清。制备方法有低温乙醇法、利凡诺法、盐析法、离子交换法等。,72,1.2 实验目标,掌握免疫球蛋白（,IgG,）的原理和方法,掌握利用紫外法、单向免疫扩散法等测定,IgG,含量的方法,掌握,SDS-PAGE,电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法,掌握层析、透析、膜分离、电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作,73,1.3 实验要求掌握的技术,柱层析分离技术,Sephadex G-25 分子筛层析,DEAE-Cellulose 离子交换层析,蛋白质提取技术,硫酸铵盐析、透析、膜分离技术等,蛋白质含量测定,消光系数法、FOLin酚法测,定IgG蛋白质含量,蛋白质分子量、纯度、活性测定,SDS-PAGE,电泳法检测、,单向免疫扩散法,74,猪脾脏DNA提取及含量鉴定,实验二、,75,2.1内容提要,为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。,动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。,76,从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。,对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。,从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般达210 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。,77,小牛胸腺,肝 脏,鱼类精子,种子胚胎,谷氨酸菌体,（7%10%）,面包酵母,（4%）,啤酒酵母,（6%）,大肠肝菌,（9%10%）,来源,动 物,植 物,微生物,78,2.1.1,DNA的基本功能,生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板；,是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；,作为,DNA,分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。,79,核酸（Nucleic acid）是以核苷酸为基本组成生物大分子。天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核糖核酸Deoxyribonucleic acid，DNA)，另一类为核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)。DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。,2.1.2,核酸的结构与功能,80,天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。,2.1.3,DNA存在形式,81,2.1.4,核酸的理化性质,RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。,除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。,DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，,一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。酸性溶液中，DNA、RNA易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,82,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白,(DNP),形式存在于细胞核中。要从细胞中提取,DNA,时，先把,DNP,抽提出来，再把,P,除去，再除去细胞中的糖，,RNA,及无机离子等，从中分离,DNA,。,DNP,和,RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,DNP,在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在,0.14 mol/L,的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的,1%,，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至,1mol/L,氯化钠中的溶解度很大，比纯水高,2,倍。,83,RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在,0.14mol/L,氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。,84,2.1.5,细胞的破碎,细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。,方法有三种：,机械方法：超声波处理法、研磨法、,匀浆法；,化学试剂法：用,SDS,处理细胞；,酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可,使细胞壁破碎。,85,由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：,破碎细胞难,；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝,肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成,DNA,断裂。,分子量大,，一般比细菌的大,2,3,个数量级，比病毒的大,4,5,个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。,86,2.2 实验目标,学习和掌握从动物组织提取核酸的原理和操作技术；,练习从动物组织提取纯化DNA操作；,学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测，确定DNA的纯度、含量与分子量。,87,2.3 实验要求掌握的技术,动物组织中DNA提取分离纯化技术,DNA含量检测:如二苯胺法，紫外法,DNA纯度检测及分子量测定:平板凝胶电泳法,88,1.,实验结果记录,2.完成课程小论文,第三部分,89,3.1实验数据,3.1.1 IgG产率(mg/100ml血清),3.1.2 IgG粗制品蛋白质含量,3.1.3 IgG回收率,3.1.4 IgG纯品含量及蛋白质含量,3.1.5 IgG分子量,3.1.6 猪脾DNA产品得率（mg/100g),3.1.7 DNA 产品纯度及分子量,3.2实验图表,3.2.1Sephadex G-25（50） 层析曲线,3.2.2Cellulose 层析曲线,3.2.3电泳图谱,3.2.4各标准曲线,3.2.5 琼扩图谱,90,第四部分,课后讨论题,91,IgG提取纯化,1.血清和血浆有什么区别？,2.IgG的主要功能是什么？,3.分级盐析法分离纤维蛋白、球蛋白和清蛋白的依据是什么？,4.离子交换法纯化IgG的理论基础是什么？为了提高IgG制品活性，在分离纯化过程中应注意控制哪些条件？,5.SDS-PAGE电泳时样品溶解液中的SDS、甘油、巯基乙醇、溴酚蓝成分、各自有何作用？,6.简述SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理。,7.为什么不连续系统PAGE比连续系PAGE的分辨率高？,92,DNA提取鉴定,1.为什么在低温下进行？,2.分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?,3.加SDS的作用？,4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?,5.加入异戊醇有什么作用？,6.结合本人实验操作的体会,试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂?,7.DNA制品都可以用哪几种方法测定其含量?试从它们原理、准确性等方面加以比较。,8.DNA溴乙锭染色法具有什么优点？操作中应注意什么？,93,