微生物限度检查法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物限度检查法,江苏省苏州药品检验所,1,细菌、 霉菌（酵母菌） 计数,1简述（,微生物限度检查的意义,）,细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。,2,细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。,该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。,3,测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、,PH,和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。,4,一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（,colony forming unit ，CFU），,而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。,5,微生物检验项目,：细菌总数测定、霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及活螨的检验。,6,2.1 设备,2.1.1 无菌室,2 设备、仪器及用具,2.1.1.1结构和要求 无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区（面积不超过10,m,2,，,高度不超过2.4,m）,由缓冲间（2个）、操作间组成。,7,操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。,无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。,8,无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（.5,W/m,3,），,紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过1,M，,并应定期检查辐射强度，不得低于70,W.cm,-2,（M,距离）。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。,9,2.1.1.2温度、湿度 无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在1826，相对湿度4060。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于4.9,Pa。,10,2.1.1.3,操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于是10000级，局部净化度为100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。,11,2.1.1.4缓冲间 缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。,2.1.1.5,洁净 级 别 及 检 查方法,通常采用尘 粒 数 及 浮 游 菌 数 或 沉 降 菌 数测 定 法。,12,洁净室（区）空气洁净度级别表,13,14,2.1.1.5.1 浮游菌数测试方法（参照中人民共和国国家标准,GB/T16293-1996）。,2.1.1.5.2,沉降菌数测定(法),15,无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30,min，,将备妥的营养琼脂平板3个(经3035预培养48,h，,证明无菌落生长。)以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30,min,后将盖盖上。,16,在3035培养箱内倒置培养48,h，,取出检查。 3个平板生长的平均菌落数不超过1个。,无菌室操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。,17,2.1.1.6,消毒处理 无菌室应在每次操作前、后均用.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30,min。,18,2.1.2其他设备、净化工作台、恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2528），微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（30008000,r/min）、,恒温水浴、电热干燥箱（250300）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。,19,2.2 仪器及器皿,2.2.1菌落计数器、显微镜（1500,X）、,电子天平或药物天平（感量0.1,g），pH,系列比色计。,20,2.2.2,玻璃器皿 锥形瓶(250300,ml，,内装玻璃珠若干)、研钵（陶瓷制，直径1012,cm）、,培养皿(,9cm)、,量筒(100,ml)、,试管(18180,mm),及塞、吸管(1,ml,分度0.01，10,ml,分度0.1)、注射器(20或是30,ml)、,注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖) 。,21,玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质吸管口上端距0.5,cm,处塞入约2,cm,的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160干热灭菌2,h,或高压蒸汽121灭菌30,min，,烘干备用。,22,2.3 用具,2.3.1 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用,70%75%,乙醇溶液浸泡）。,2.3.2 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。,23,2.3.3 接种环 (白铱金或镍铬合金， 环径45,mm、,长度610,cm)、,乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12,cm）、,实验记录纸等。,24,3 试液,3.1消毒液,3.1.1,0.1%,苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。,3.1.2,5%,石碳酸溶液 (配好后装入玻璃消毒缸内， 供消毒带菌吸管用) 亦可选用其他适宜消毒液。,3.1.3,75%,乙醇溶液,3.1.4 碘酊或碘伏溶液,25,3.2 稀释剂和试剂,3.2.1,0.9%,无菌,氯化钠溶液 (附录,3.1,),3.2.2 无菌聚山梨酯-,80,3.2.3 无菌聚山梨酯-,80,氯化钠溶液 (附录,3.2,),3.2.4 无菌磷酸盐缓冲液(,pH7.2,) (,附录,3.3,),3.2.5 无菌,0.1%,氯化三苯四氮唑溶液(,TTC,) (,附录,2.15,),26,4 培养基,4.1 营养琼脂培养基 (附录,5.2,),4.2 玫瑰红钠琼脂培养基 (附录,5.3,),4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖,(,YPD),琼脂培养基,(附录5.4),27,培养基制备应注意：,4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基,pH,值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上的试剂。,28,4.3.2 配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。,4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的确,2/3,，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。,4.3.4 培养基配置后应在2,h,内灭菌，避免细菌繁殖。,29,4.3.5 灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。,4.3.6 勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。应用水浴或微波炉加热。,30,5 供试品抽样、保存及检验量,5.1 抽样,5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（,2,个以上最小包装单位）的,3,倍量（以备复试）。,5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。,31,5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。,5.2 保存,5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。,32,5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。,5.3 检验量,5.3.1 所有剂型的检验量均需取,2,个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自,4,丸、,4,片以上）。,33,5.3.2 固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检验量为,10,g,。,5.3.3,液体制剂检验量为,10,ml,。,5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为,3050,cm,2,，,化学药及生化药膜剂检验量为,10,cm,2,。,34,5.3.5,特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3,g。,液体制剂采用原液者不得少于6,ml，,采用供试液者不得少3,ml，,外用药品不得少5,g。,35,6 操作方法,6.1 试验前准备,6.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（,1,ml,、,10ml,）、,量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。,36,6.1.2,开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30,min。,6.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用,0.1%,苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。,37,6.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。,38,6.2 供试液的制备,6.2.1 液体供试品 取供试品,10,ml,，,置灭菌锥形瓶中，加入,90,ml,稀释剂，摇匀，作为,1:10,供试液。,含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。,39,6.2.2 固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品,10,g,，,置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入,100,ml 0.9%,无菌氯化钠溶液，用匀浆仪,（30005000,r/，24min,），,振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置,451,水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置,451,水浴振摇溶解。,40,6.2.3,非水溶性供试品 软膏剂、乳膏剂 称供试品5,g（5ml），,加入含已灭菌溶化并保温45左右的司盘-,80,5,g、,单硬脂酸甘油酯3,g、,聚山梨酯-,80,10,g,混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入45左右的0.9%无菌氯化钠溶液85,ml，,边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。,41,油剂 取供试品,10,ml,，,加入无菌聚山梨酯,-,80,58,ml,，,摇匀，再加入稀释剂至,100,ml,。,栓剂 称取供试品,10,g,，,置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置,45,水浴保温,10,min,，,使溶，加入无菌聚山梨酯-80,58,ml,，,振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯-80,总量为100,ml）,，,摇匀。,42,6.2.4,气雾剂 将供试品置冰箱（4）,h，,取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂全部抛出。,43,以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-,80,液）此液即为供试品原液。,6.2.5 膜剂 中药膜剂一般取,3050,cm,2,，,将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中， 加入稀释剂,100,ml,，,于,451,水浴保温，振摇使溶。,西药药膜一般取样为,10,cm,2,，,制备供试液方法同上。,44,6.2.6,茶剂 取供试品10,g，,置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100,ml，,振摇30,s，,以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30,min）。,以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，增加稀释剂，制成都是1：201：100供试液。,45,6.3 供试液的稀释（10倍递增稀释法）,6.3.1,取23支灭菌试管，分别加入9,ml,灭菌稀释剂（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10,ml,吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。,46,6.3.2,另取1支1,ml,灭菌吸管吸1：10均匀供试液1,ml，,加入装有9,ml,灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：10,2,、1：10,3,、1：10,4,等适宜稀释级（至少共3级）。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。,47,在作10倍递增稀释时， 吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5,cm，,反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许， 然后提起吸管， 贴于试管内壁调整液量至刻度， 再沿第2级稀释管的内壁靠近液面(勿接触液面)缓慢地吹出全部供试液(吸管内应无粘附或残留液体)，然后将吸管放入消毒液缸内。,48,6.4 注平皿 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1,ml,至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注23个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1,ml,供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。,49,同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1,ml,吸管吸取稀释剂各1,ml，,分别注入4个平皿中。其中2个作细菌阴性对照；另二个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用,YPD,琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。,50,6.5 倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红纳琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用,YPD,琼脂）熔化，冷至45时，倾注上述各个平皿15,ml，,以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。,51,6.6,培养 细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48,h。,霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72,h。,52,6.7 菌落计数,6.7.1,一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。,53,6.7.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。,54,6.7.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（,12,个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。,55,或用,0.001%,TTC,营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。,有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001%,TTC,营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。,56,6.7.4 若平板上有2 个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。,57,6.7.5,计录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。当菌落数在15以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为04，17，2-9，310，412，514，615。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。,58,6.7.6,在下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间：,6.7.6.1 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24,h，,霉菌点计需在48,h,作初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。,59,6.7.6.2 在48,h,点计细菌，72,h,点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间47天，再点计菌落数。,6.7.6.3 对有疑议的供试品以,YPD,培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。,60,6.7.7 供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠平板点计霉菌及酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按,YPD,琼脂平板点计酵菌落数，二者合并为霉菌及酵母菌数。,61,6.8,菌落数报告规则:,6.8.1,细菌数选取平均菌落数在,30,300,之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选取平均菌落数在,30100,之间的稀释级作为报告菌数的依据。,如只有1个稀释级平均菌落数在此30300（30100）之间，则将该稀释级的菌落计数器乘以稀释倍数报告（见附表例6.8.1）。,62,6.8.2,如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30100）时，则按比值计算。当比值2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表附6.8.3）。,63,比值=,高稀释级平均菌落数稀释倍数,低稀释级平均菌落数稀释倍数,64,6.8.3,如有3个稀释级平均菌落数均在30300 (30100)之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告(同6.8.2)，(见附表例6.8.3)。,6.8.4,如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表6.8.4）。,65,6.8.5 如各稀释级平均菌落数均不在,30300 (30100,)之间，则以最接近,30或300（100）,的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表,6.8.5）,。,6.8.6 如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数,小于1时，应报告菌落数为10个/,g,或,ml（,见附表例6.8.6）。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未检出霉菌及酵母菌/,ml。,66,6.8.7,当各稀释级平均菌落数小于30时，如高稀释级平均菌落大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌落数（见附表例6.8.7）。,67,培养基稀释法测定,培养基稀释法：,取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1,ml，,分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2,ml,或0.2,ml），,每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15,ml，,混匀，凝固后，倒置培养，计数。,68,5个或5个以上平板点计的菌落之和，即为每1,ml,菌落计数器，共得3 组数据。以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。,69,6.9 结果报告,6.9.1 菌落数在100以内时， 按实有数据报告。,6.9.2 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。,70,6.10 复试 供试品细菌数、霉菌及酵母数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。,71,7,注意事项,7.1 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌作具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。,7.2 从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1,h,内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。,72,7.3 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。,7.4 为避免细菌菌落蔓延生长，宜采用下列方法处理：,7.4.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机12,h,后合盖，放入培养箱培养；,73,7.4.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。,7.4.3,加,TTC,于倾注培养基前，在每1000,ml,营养琼脂内加入灭菌1%,TTC,溶液1,ml（,最终浓度为0.001%），混匀后倾注平皿。,74,7.5 一般情况下，以营养琼脂平板计数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉菌、酵母菌数。在特殊情况下，如营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数，则营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报告；反之，如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。,75,如营养琼脂平板生长的霉菌、酵母菌数或玫瑰红钠琼脂平板生长的细菌菌落数超过该品种微生物限度规定时，经复试2次，如3次结果的平均值仍超过规定，应判供试品不合格。,76,8 检验报告书,本品按中国药典2000年版微生物限度检查法标准检验，结果符合或不符合规定。,77,二、大肠杆菌检查法,1简述,大肠杆菌即大肠埃希菌（,Escherichia coli），,为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种。,78,大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。,在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。,79,用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（4-,Methylumbelliferyl-D-glucuronide，,即,MUG）,和靛基质（,Indole）,试验检查大肠杆菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种,MUG,蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如,MUG、Indole,试验为阳性或阴性即可报告结果，如,MUG,与,Indole,试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。,80,原理:利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。,实验证明96% 的大肠杆菌含,-,葡糖苷酸酶（,-glucuronidase，GUD），,约10% 的沙门氏菌属一些菌种也含有此酶。,81,MUG,被,GUD,水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强行千万倍，易于观察，没有主观性，因而用,MUG,鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。,82,单一的,MUG,鉴别大肠杆菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将,MUG-,靛基质试验结合，用,EMB,琼脂平板分离，辅以,IMViC,试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99%。,83,三、沙门菌检查法,1. 简述,沙门氏菌属是肠杆菌科的重要致病菌，沙门菌分5个亚属，包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌在内，迄今已发现2000多个菌型。,84,药品中沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每,g（,或,ml）,药品中是否检出沙门菌作出检验报告。,由于沙门菌菌型繁多，各菌型的生化及血清学特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌增培养基和两种分离培养基，不可能是所有沙门菌的最适增菌及分离条件。,85,此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤 。,86,四、铜绿假单胞菌检查法,1简述,铜绿假单胞菌（,Pseudomonas aeruginosa），,习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。,87,本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤，眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度、国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。,铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。,88,五、金黄色葡萄球菌检查法,1 简述,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus）,为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界，空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及与外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。,89,本菌抵抗力较强，干燥情况下能生存数月，8030,min,的条件下尚能存活，5%石碳酸或0.1%升汞溶液1015,min,才会被杀死。,金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色镜检和血浆凝固酶试验等步骤进行。,本法适用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。,90,六、 活螨检查法,1简述,螨，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目。种类繁多，分布甚广。 其生活习性各异，分为自由生活和寄生生活两种类型。在土壤、池沼、江河和湖海里，动、植物体上，贮藏食品和药品中，都可能有它们的存在。,91,药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。,螨可蛀蚀损坏药品，使药品变质失效，并可直接危害人体或传播疾病。能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统等的疾病。因此，药品特别是中成药，必须进行活螨检查。,92,微生物限度标准（单位：个/,g,或个/,ml）,剂型,细菌数,霉菌酵母菌数,片剂,1000,100,酊剂,100,100,栓剂,100,10,胶囊剂,1000,100,软膏剂,100,100,93,剂型,细菌数,霉菌酵母菌数,一般眼膏剂,100,-,一般滴眼剂,100,-,丸剂（滴丸、糖丸）,1000,100,气雾剂,100,10,糖浆剂,100,100,94,剂型,细菌数,霉菌酵母菌数,膜剂,100/,cm2,10/,cm2,颗粒剂,1000,100,口服溶液剂、混悬剂、乳剂,100,100,散剂,1000,100,外用散剂,100,100,95,剂型,细菌数,霉菌酵母菌数,滴耳剂,100,10,滴鼻剂,100,10,洗剂,100,100,搽剂,100,100,凝胶剂,100,100,96,革兰染色,1,以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手）固定。2 滴加结晶紫染液，染色1,min，,水洗。3 滴加碘液，媒染1,min，,水洗，以滤纸吸干余水。,97,4,滴加95%乙醇，脱色2030,S，,水洗。,5,滴加沙黄染液，复染1,min，,待干后，镜检。6 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。,98,7,注意事项：,a,玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。,b,培养物的菌龄以1624,h,为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易成红色。,C,脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性,。,99,结束！,谢谢！,100,