MHC多聚体分子免疫学

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,MHC多聚体分子免疫学,主要组织相容性复合体,(major histocompatibility complex, MHC):,位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群,其编码产物参与抗原提呈、制约细胞间相互作用及诱导免疫应答，是介导移植排斥反应的主要抗原。,*,人类,MHC HLA,复合体,编码,HLA,抗原,;,*,小鼠,MHC H-2,复合体,编码,H-2,抗原,;,1936,年,Peter,用近交系小鼠发现小鼠的移植排斥现象,同种异型移植,同种同型移植,决定移植排斥反应的基因：血细胞抗原,2,基因,H-2,系统,斯内尔,George D. Snell,美国,杰克逊实验室,1903,年,-1996,年,1948,年证明了,H-2,基因复合体,肾移植后出现的排斥反应,人白细胞表面的某种抗原,人类白细胞抗原,（,human leukocyte antigen, HLA,）,1954,年，,J.Dausset,发现了人类的,MHCHLA,系统。,多塞,Jean Dausset,法国,巴黎大学血液免疫实验室,1916,年,2009,年,贝纳塞拉夫,Baruj Benacerraf,美国,哈佛大学医学院,1920,年,2011,年,1963,年，发现了免疫应答（,Ir,）基因，并发现,Ir,基因与,MHC,紧密连锁。,斯内尔,George D. Snell,美国,杰克逊实验室,1903,年,-1996,年,多塞,Jean Dausset,法国,巴黎大学血液免疫实验室,1916,年,-2009,贝纳塞拉夫,Baruj Benacerraf,美国,哈佛大学医学院,1920,年,-2011,1980,年,诺贝尔生理学医学,奖授予,Snell,、,Dausset,和,Benacerraf,三位科学家，以表彰他们在“调节免疫反应的细胞表面基因决定性结构方面的杰出研究工作。”,HLA,Class II,DP,LMP/TAP,DM,DQ,DR,1,B,C,A,HLA,Class I,1452,965,626,A,B,C,No of,polymorphisms,a,b,a,b,a,b,3,85,2,2,8,138,35,107,DR,DP,DQ,No of,polymorphisms,MHC,多态性,1,3,2,2,m,2,1,2,1,Class II,(HLA-DR),Class I,（HLA-A,B,C,）,HLA,提呈抗原肽的多样性,pMHC,作为,T,细胞特异性的结合配体,多样性机制,a b g d,V 70 52 10 7,D 0 2 0 2,J 61 13 2 2,组合多样性,33,20 28,N,序列插入,37 311,V,区基因数,6,6x10,2,连接多样性,2x10,11,10,13,总,计,10,18,10,15,T,细胞与,TCR,的多样性,TCR与pMHC特异性结合的可能应用,领域？,pMHC,作为,T,细胞特异性的结合配体,检测抗原特异性,T,细胞,pMHC,与,TCR,结合后作用的双面性,特异性增强,特异性抑制,T,细胞的双信号识别,pMHC,作为,T,细胞特异性的结合配体,抗肿瘤,抗感染,抗移植排斥,抗自身免疫,检测抗原特异性,T,细胞,可溶性,pMHC,与,TCR,的亲和力低,MHC,多聚体,抗原特异性,T,细胞检测与调控的重要工具,pMHC,多聚体技术的出现为,TCR,提供了高亲和力配体,1996,年,Altman,等人建立了,pMHC,四聚体技术,Science, 1996, 274(5284):94-96.,被引用次数：,2368,1993,年,Porto,等人建立了,pMHC,二聚体技术,PNAS,1993, 6671-6675,pMHC,四聚体技术,1996,年,Altman,等人建立的,MHC-,抗原肽四聚体技术，,已成为特异、敏感的检测,T,细胞克隆的工具。,解决了,TCR,与其配体,pMHC,单体低亲合力结合的问题，从而实现对带有特定表型,TCR,的,T,细胞的特异性染色,。,pMHC,四聚体的应用已经证实在抗病毒、抗肿瘤研究中具有重要的意义,pMHC,单体：,每一个,MHC,分子与其相应限制性的肽段结合，并具有酶催化的生物化位点,pMHC,四聚体：,4,个生物素化的可溶性,MHC-,抗原肽复合物单体与标记的亲合素结合形成的复合物,pMHC I,类分子四聚体结构示意图,*,pMHC,单体：,每一个,MHC,分子与其相应限制性的肽段结合，并具有酶催化的生物化位点,*,pMHC,四聚体：,4,个生物素化的可溶性,MHC-,抗原肽复合物单体与标记的亲合素结合形成的复合物,MHC,四聚体结构示意图,HLA,四聚体种类,HLA I,类分子：,HLA-A2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A28,，,HLA-B8, HLA-B27,等,HLA II,类分子：,HLA-DR1, HLA-DR4, HLA-DQ,等,非经典,MHC,分子：,HLA-E, HLA-F HLA-G,等,MHC,类似分子：,CD1d,，,MR,1,MHC/,抗原肽四聚体制备过程示意图,MHC/,抗原肽四聚体,pMHC,四聚体与,TCR,的特异性结合,检测抗原特异性,T,细胞,分选抗原特异性,T,细胞克隆,刺激抗原特异性,T,细胞,调节抗原特异性,T,细胞,MHC,四聚体检测抗原特异性,T,细胞,四聚体对特异性,CTL,的检测,MHC,抗原肽,特异,CD8,+T,细胞频率,(%),HIV,Human,HLA-A2*0201,Gag77-85,0.8 (PBMC),HIV,Human,HLA-A2*0201,Pol476-484,0.8 (PBMC),HIV,Human,HLA-B*3501,Env77-85,2.7 (PBMC),EBV,Human,HLA-A2*0201,BMLF1,6 (PBMC),EBV,Human,HLA-B8,BALF1,44 (PBMC),SIV,Monkey,Mamu-A*01,Gag191-189,10.3 (PBMC),LCMV,Mouse,H-2L,d,NP118-126,56 (spleen),Virus,Species,MHC,四聚体检测特异性,T,细胞的频率,通过四聚体测得的病毒感染的急性期与记忆期病毒特异性,CD8+T,细胞是原先估计值的,10,倍,惊人的体内抗原特异性,T,细胞增长速度，在,LCMV,感染的,3-5,天，抗原特异性,T,细胞增倍的时间只需,6-8,小时。,与原认为的在病毒感染免疫应答中大部分,T,细胞增殖是非特异性相反，四聚体染色结果说明,T,细胞的免疫应答主要都是针对病毒抗原，非特异的活化很少,了。,MHC,多聚体检测抗原特异性,T,细胞的基本原理？,pMHC,与,TCR,的特异性结合提供了结构基础,pMHC,多聚化为检测抗原特异性,T,细胞提供了足够的亲和力。,pMHC,多聚体引入的荧光标记实现了抗原特异性,T,细胞的流式检测,pMHC,四聚体分选抗原特异性,T,细胞,pMHC,四聚体刺激抗原特异性,T,细胞产生,亲和素,B7,pMHC,提供第一活化信号,B7,与,T,细胞的,CD28,结合提供共刺激信号,生物素化的,pMHC,自身免疫及移植物排斥,Maile,等人,利用雌性,HY-TCR,转基因鼠模型对其移植雄性鼠的皮肤，,体内注射,HY-I,类分子四聚体发现可诱导特异性的,CD8+T,细胞活化，,但若成倍增加注射四聚体的剂量，则通过诱导,T,细胞无能或,AICD,反应清除雄性特异性的,CD8+T,细胞，在体内诱导特异性,T,细胞耐受,.,pMHC,四聚体在肿瘤免疫治疗的潜力,Ogg,与,Robert,等人报导了一种新的抗瘤策略：应用肿瘤特异性的抗体与,pMHC,四聚体结合形成复合物，通过特异性抗体靶向结合于肿瘤细胞表面从而使肿瘤细胞对四聚体特异性的,CTL,的溶解效应敏感。,pMHC,二聚体的构建策略,MHC,二聚体,pMHC,pMHC,二聚体对抗原特异性,T,细胞的检测,利用,pMHC,二聚体诱导抗原特异性,T,细胞,利用加载,pMHC,二聚体的细胞作为抗原提呈细胞,该抗原提呈细胞仅提呈单一表位,适用于诱导普通抗原特异性,T,细胞与同种抗原特异性,T,细胞,在体外制备肿瘤抗原特异性,T,细胞，探索抗肿瘤的有效方法。,在体外诱导病毒抗原特异性,T,细胞，寻求打破慢性病毒感染的新的途径。,获得单一表位特异性,T,细胞，研究,T,细胞的识别与效应机制,利用,pMHC,二聚体诱导抗原特异性,T,细胞,可溶性,pMHC,二聚体特异性抑制抗原特异性,T,细胞,可溶性,pMHC,二聚体诱导特异性,T,细胞耐受的示意图,可溶性,pMHC,二聚体特异性抑制抗原特异性,T,细胞,可溶性,pMHC,二聚体在抗移植排斥反应中的应用,O,Herrin,等人利用小鼠可溶性,pMHC,I,类分子二聚体体,外诱导同种,T,细胞耐受,Fried,等人应用大鼠,pMHC,二聚体实现体内保护同种,移植物的作用,可溶性,pMHC,二聚体在抗自身免疫性疾病中的应用,Masteller,等人应用,pMHC,II,类分子作为治疗性的生物分子应用于转,TCR,而产生的糖尿病的老鼠。,实验结果显示，可溶性,pMHC,II,类分子二聚体可特异性的抑制自身反,应性,T,细胞，诱导自身反应性,T,细胞耐受,MHC,多聚体的应用领域？,1.,检测抗原特异性,T,细胞,2.,分选抗原特异性,T,细胞克隆,3.,诱导抗原特异性,T,细胞,4.,调节抗原特异性,T,细胞,感染免疫,肿瘤免疫,3.,自身免疫性疾病,4.,同种移植排斥反应,MHC 类似分子,-,MHC,Ib,分子,CD1,分子,MR1,分子,H2-M3,分子,HLA-E,HLA-G/Qa-1,Qa-2,个体多样性低,CD1,分子递呈途径,1. CD1,的特征,分五型：,CD1A,、,B,、,C,、,D,、,E,与,b,2m,组成二聚体；,与,MHCI/II,类分子有,30%,同源性，无多态性；,CD1,表达于专职,APC,表面，还可存在于内体,/,溶酶体腔室中，酸性环境改变其构象，与抗原结合。,2.,抗原递呈特征,主要递呈糖脂或脂类抗原，特别是分支杆菌的某些成分；,递呈给,CD4,+,T,、,CD8,+,T,、,CD4,-,CD8,-,T,、,+,T,细胞。,脂类抗原的,CD1,分子提呈途径,CD1d-限制性T细胞NKT细胞,CD1d-restricted iNKT Cells,IL- 4, -10, -13,IFN-,g,IL-17,TNF,a,Surface phenotype -,TCRint, NK1.1+,CD4+ or CD4-CD8-,TCR usage - V,a,14-J,a,18 (V,a,24-J,a,18 in,human), preferentially associate with V,b,8,V,b,7, and V,b,2,Can be detected by,-,galactosyl,ceramide,(,-,GalCer,) -loaded CD1d tetramers,Rapid release of cytokines upon activation,Immunological functions,-,immune,responses against pathogens, anti-tumor,immunity, autoimmunity,CD1d,Invariant TCR,Type I NKT cell,(iNKT cell ),APC,MR1分子提呈途径,Lars,Kjer-Nielsen,et,al,Nature,2012,Nov,491:,717-723,1,2,3,2m,6-FP,6-FP,1,2,2m,3,90,o,rotation,MR1,HFE,MHC-1,CD1d,MR1,限制性,T,细胞,MAIT,细胞,*,MAIT- Mucosal associated invariant T cells,*,Surface phenotype: Mainly DN,some,CD8,in,human,TCR usage: Semi-invariant: mV,19/mVb6, 8,hV,7.2-Ja33/hVb2, 13,Predominantly,in,the,Gastrointestinal,tract,;,abundant,in,human,blood,and,liver.,Absence,in,germ-free,mice,Can be detected by MR1-6-FP tetramer,Comparison,of,NKT,and,MIAT,cells,抗原特异性,T,细胞的检测方法,传统功能实验,依赖于抗原特异性,T,细胞在体外的增殖活力及细胞毒效力的功能试验,氚标记胸腺嘧啶核苷（,3H-TdR,）掺入率测定,T,细,胞的,增殖,水平,MTT,法测增殖,Cr51,释放法检测,T,细胞的特异性,杀伤,功能,LDH,法测杀伤,细胞增殖实验原理,加,3H,标记的,DNA,前体,(3H,胸腺嘧啶苷，,3H-TdR),T,细胞增殖表现为,DNA,复制，,细胞合成,DNA,量倍增,3H-TdR,掺入新合成的,DNA,中,根据掺入的多少,推测细胞增殖程度,细胞杀伤实验原理,靶细胞被特异性杀伤,51Cr,释放入培养上清,51Cr,掺入培养的靶细胞中，,使其摄入胞内,上清中的辐射强度即可,计算出特异性,CTL,的杀伤效率,传统功能实验定量检测,T,细胞功能,有限稀释法（,LDA,）,将,T,细胞有限稀释为单个细胞,利用功能实验检测有功能的,T,细胞数目,计算抗原特异性,T,细胞的前体频率,细胞内细胞因子染色检测,T,细胞功能,T,细胞接受抗原特异性刺激后发生分泌细胞因子的功能效应,通过检测分泌细胞因子的,T,细胞检测抗原特异性的,T,细胞,ELISPOT,法检测抗原特异性,T,细胞,检测的细胞分泌细胞因子,抗细胞因子抗体包被固相载体,加入酶标细胞抗体，显色,阳性斑点代表特异性,T,细胞,几种定量检测抗原特异性,CTL,的方法比较,方法,分析类型,功能,限制,LDA,功能分析,细胞总体功能分析,体外至少培养,6-7,天,操作比较烦琐,敏感性低,10-100,倍,ELISPOT,功能分析,单细胞水平分析,所需细胞数较少,操作可自动化,培养,1-2,天,不能回收细胞进行一步功能研究,敏感性低,30,倍,pMHC,四聚体,物理分析,可对标本直接检测,可收集所需细胞进行进一步功能分析,四聚体制备后，操作简便、敏感度高,需要制备相应的四聚体,受,HLA-,多态性的限制,谢谢观赏,