氨基酸的分离纸层析法

实验一 氨基酸的分离鉴定 纸层析法,【实验目的】,学习氨基酸纸层析法的基本原理,掌握氨基酸纸层析的操作技术,纸层析法,属于分配层析，它是以层析滤纸为载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸的极性，在固定相和流动相中的,分配系数,不同而进行分离的（依据相似相溶原理）。,【实验原理】,分配系数,：K,两种溶剂A、B，一种溶质M，即可溶于A，也可溶于B。先将M溶于A中，然后加入B，这时A中的M将部分转,移到B中，当达到平衡时，只要温度不变，M分配于A、B,中的浓度Ca、Cb不会改变，两者的比值是一个常数K。K,被称为M在A和B中的,分配系数,。即K=Ca/Cb,它是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。,氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的。,在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。,【实验器材与试剂】,1、层析缸,2、毛细管,3、喉头喷雾器,4、培养皿,5、层析滤纸(新华1号),6、铅笔（直尺）,7、分液漏斗,8、吹风机,9、 正丁醇,10、冰醋酸,11、氨基酸标准样品,12、氨基酸混合样品,13、0.1%水合茚三,酮正丁醇溶液,【实验步骤】,1、配扩展剂：,正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml,顺序：正丁醇冰醋酸水，放入分液漏斗中，充分混匀。静置约10min后分层，放出下层水层，其余的倒入培养皿中。,2. 准备滤纸,取一张层析滤纸，距纸底边2cm处用铅笔划一横线，沿线每隔2.5cm作一记号为点样处，点样处也不要太靠近两侧边（约距1.5cm），会产生边缘效应。,3.点样,（顺纸纹方向）,用毛细管依次吸取标准品氨基酸和混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸面，样品扩散直径小于3mm。一滴滴完后用,冷风,吹干，再点第二次，共点三次。,4.扩展,将点完样的滤纸两侧面对齐，用针线缝合，纸的两边不能接触。将点样后的滤纸直立于培养皿的扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm ）当溶剂展层至滤纸上沿2cm处展层结束，取出滤纸。用铅笔画出展层前沿位置，在,通风橱中,用,热风,吹干。,5. 显色,用喉头喷雾器均匀喷上0.1茚三酮正丁醇溶液，然后用,热风,吹干即可显出各层析斑点。,6. 测量、计算：,分别测量X、Y值，计算各氨基酸的Rf值。 Rf= XY,注意事项,1 、铅笔、格尺自备。,2、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。,3、吸取样品的毛细管不可混用。,4、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距 离不能太近。,5、吹干时一定要保证完全吹干。,6、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。,7、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于3mm。,8、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。,9、使用移液管时，应先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。,10、 15ml水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。,11、 实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸及其中的培养皿。,12、有机废液倒入右侧实验台上的“废液收集有机溶剂”大试剂瓶中。,13、 实验结束, 回收竹夹子、A4复印纸、电吹风。,14、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸贴在其中一位同学的实验报告上。,15、坐椅推入实验台下，空出过道。,【,结果分析与讨论,】,【,思考题,】,通过本次实验，讨论下列问题：,（1）简述纸层析的原理。,（2）判断氨基酸极性大小顺序，讨论AA极性与Rf的关系？,（3）什么是Rf值？影响的主要因素是什么？,下周实验：脂质的薄层层析,（405实验室）,每组清洗一块玻璃板，置于烘箱中备用。,