同位素示踪技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,3,章 同位素示踪技术,1,第,3,章 同位素示踪技术,同位素示踪,通过同位素标记核素或同位素标记化合物跟踪研究相关物体运动过程及其规律的一种研究方法。,3.1,同位素示踪的基本依据和特点,2,依据,放射性,同位素,元素的同位素具有,1),化学及生物学性质同一的示踪性,2),物理性质差异的可探测性,稳定性,同位素,元素的同位素具有,1),化学及生物学性质同一的示踪性,2),物理性质差异的可探测性,3),同位素的天然组成恒定,3,4,在水文、地理及生物学中，相关周期表中的同位素要览。点击黄色标注的元素，即可链接到相应网页，可获得关于其特性及应用的简要说明。,LINK,：,USGS,（,U.S. Geological Survey,）,5,6,特点,放射性,1.,测量灵敏度高 活度检测限,A,min,=1Bq,相应物质的质量检测限,10,-12,10,-17,g,2.,能与内源物质相区分，可在生理稳恒条件进行代谢研究。,3.,样品制备及测定简便。,4.,结合显影或显像技术可进行定位定量或半定量测定。,稳定性,1,.,现代质谱核素丰度测定的精度可达,0.01%.,2.,利用同位素稀释原理可计算样品中的物质来自示踪剂的比率。,3.,样品制备分析需大型设备。,4.,无放射性，无衰变，无污染。有时是唯一的。,7,3.2,标记核素与标记化合物,3.2.1,放射性同位素,常用放射性核素,8,3.2.1,放射性同位素,标记化合物,化合物分子中某一元素的一个或数个普通核,素原子被其放射性同位素核素原子所替代。,1),标记方式,均匀标记,U,标记原子在相应位置均匀分,布，丰度相同，由生物合成产生。,不定位标记,G,标记原子在相应位置丰度,不同，由同位素交换法产生。,定位标记,标记原子在分子中有确定位置，由,化学合成产生。,9,2),制备,有机合成,简单标记化合物,复杂标记化物,如：,生物合成,饲喂标记前体生物系统生物大分子标记,化合物。,10,生物合成示例,11,同位素交换,RH+T,2,RT+ HT,RH+T,2,O RT+THO,氚标可用所谓的气爆法进行,.,把底物涂到石英瓶内,抽真空后,充入氚气,通过高频放电或紫外光照射使氚气活化,促进交换,.,反应结束,抽吸剩余氚气,用易挥发溶剂转移产物,最后除去溶剂,.,12,3),特点,组成及总量不恒定,放射性纯度,所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总,放射性活度的百分数,。,放化纯度,在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活,度占该核素总活度的百分数。,放化纯度可用放射性薄层分析测定,。,13,放化纯度说明示例,如碘,-131,的,NaI,制剂，除,131,I,-,，还可能有,131,I,2,， 若放化,I-131NaI,的放化纯度,95%,，则表示以其他化学状态存在的碘,1315%,。,14,辐射自分解,标记化合物的辐射对其自身所产生的离解作用。,微量和低浓度,操作量为微居里,(10,-7,-,-14,g ),，因浓度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共沉淀,。,15,4),贮藏,开瓶分装,降低放射性溶液的浓度，降低比活度。,低温,(2-4),及避光保存。,16,3.2.2,稳定性同位素,名词,核素的丰度,一种核素在其所属元素的同位素原,子中所占的原子百分数。,核素的自然丰度,核素在自然状态下的丰度。,核素的原子百分超,核素的丰度较自然丰度超出,的部分。,17,常用核素,常用的稳定性示踪核素列表,Element Heavy isotopes Light isotopes,H,2,D (0.0156%),1,H (99.9844%),N,15,N(0.366%),14,N(99.634%),C,13,C(1.108%),12,C(98.892%),S,36,S(0.02%),34,S(4.22%),32,S(95.02%),33,S(0.75%),O,18,O(0.204%),16,O(99.759%),17,O(0.037%),18,标记化合物,通过,富集,标记元素的稀有同位素核素或,贫化,其普通同位素核素所形成的化合物，以及核素的自然丰度因环境而异有较大的同位素分馏变异，带有,原位,标记“指纹”特点的化合物。,19,20,21,22,3.3,试验设计的一般原则和程序,3.3.1,放射性同位素示踪,示踪剂的选择,考虑因素 核素,(,射线种类、,能量和半衰期,),，标记方式。,例：,有机磷农药马拉硫磷残留研究，,14,、,32,、,35,标记均可，降解中的去甲基作用,(,14,CH,3,),，酯键的水解作用,(,14,，,2,5,),，硫代磷酸脂键的反应，用,32,P,或,15,标记。,23,示踪剂量的估算,引入量,标记化合物的用量，按一般实验要求确定。,放射性总活度或比活度，要求能被精确测量，而又不过强。,分无或有内源物示踪两种情况讨论。,24,无内源,此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释,化合物的比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求直接估计得到。,式中,n,min,样品的最小计数，最好为,2000 -4000cpm;,仪器的,计数,效率；,W,试样重量；,C,样品中,示踪物的含量。,若实验期间,放射性有明显衰变,应进行衰变校正。,25,举例,无内源物质的示踪试验,如农药残留试验,试样重,1,克,要求计数率达到,2400 cpm,已知仪器的探测效率为,80%,若要求对样品的检测灵敏度为,0.1ppm,问示踪标记化合物的比活度至少为多少,.,26,有内源,此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。对示踪剂比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响。示踪剂的比活度可由如下两种方法之一估计。,估值法,式中，,W,，,C,为试样重及物质浓度或含量；,P,dff,为来自示踪剂的比率。,27,倒推法,以盆栽为例，设植株总重,M,2,，试样重,M,1,最低计数率,n (n4n,b,本底,),。考虑：,不均匀分布因子,P,1,试样的平均计数率：,仪器的探测效率,试样的活度：,总样本量,M,2,供试植株的总活度：,28,验期间的衰变,引入时植株的活度：,A,3,2,2,，,植株的吸收利用率,应引入的活度：,回代得到：,29,举例,有内源物示踪实验示踪剂引入量的估计。以,32,P,标记肥料实验为例，设实验持续,100d,测量样品量取,1g,植物平均含磷,0.4%,，其中来自肥料的比里率为,Pdff(10%-50%),按,25%,估算，若样品用固闪杯法测量，仪器的探测效率为,80%,，要求计数率为,2000cpm,试估算,32,P,标记肥料的比活度。,30,示踪剂的准备,开瓶分装,对商业制剂进行必要稀释和转化的操作。,工作程序,1.,核查包装说,例 磷,32,标记磷酸氢钠制剂,1),标记化合物名称,Na,4,2),物理化学状态 溶液，无色透,明,3),溶液体积,5 mci/ml,4),比活度,0.5 mci/mmol,5),放射性总活度,2.5 mci,6),放射化学纯度,100%,7),测定日期,2000.3.12,8),包装情况 安培瓶盛装，再置,铝罐内。,2.,确定稀释倍数,浓度稀释关系,S,0,V,0,=S,1,V,1,式中，,S,0,、,S,1,和,V,0,、,V,1,分别为稀释,前后制剂的放射性浓,(ci/ml),，,及体积。,比活度稀释关系,:,a,0,m,0,=a,1,(m,0,+m,1,),式中，,a,0,、,a,1,分别为标记化合物稀,释前后的比活度，,m,0,和,m,1,为标记化,合的质量和所加稳定性同位素载,体的质量。,31,示踪剂的准备,3.,开瓶分装操作 采用屏蔽和时间防护等措施，妥善处理废物。,4.,使用前测定活度及放化纯度，必要时应纯化。,32,示踪剂的引入,植物体,根部,水培、沙培、土培。,地上部,涂抹法、注射法、点滴法。,动物体,注射法、涂布渗入法、吸入法,。,33,示踪剂引入系统示例,1,Jim Rasmussen, el at, 2007. Soil Biology,Biochemistry 39,804-815,.,研究目的,：套种体系碳、氮的转移、沉积和淋溶动态。,实验布置,：田间微区，插入,PVC,柱，内径,30cm,。,示踪剂,：,14,C-,尿素，,15,N-,尿素。,标记方法,：叶缘吸收。植物叶片插入到盛有示踪液的小管，小管由布拉膜密封，持续标记,5,天。,14,C-,尿素标记用,2ml,管,盛,1ml,标记液，活度,7.710,6,dpm(3.5,Ci);,15,N-,尿素用,5ml,管,盛,2ml 0.75%(w/v),丰度为,99%,的,15,N-,尿素标记液。在整个生育期,14,C,标记重复,3,次，,15,N,标记重复,5,次,。,34,2. Jessica L.Butler, el at,2004. Soil Biology,Biochemistry 36,371-382.,研究目的,：新固定的光合作用产物在植物根际的分布与周转。,实验布置,：盆栽。,示踪剂,：,13,CO,2,.,标记方法,：整株饲喂。盆栽植物移入气密的透明有机玻璃光合室进行标记，光合室长,宽,高为,40.540.558.5cm,3,每次标记,11,个盆。,13,CO,2,在光合室直接发生,标记开始时监测光合室,CO,2,的浓度约为,200ppm(v/v),，滴入,1.5ml 1.5M,乳酸到盛有含,22.4mg NaH,13,CO,3,(,13,C,丰度为,99%),此时光合室,CO,2,的浓度大约升到约,600ppm,待,CO,2,的浓度降到,200ppm,，再在另一个含,22.4mgNaH,13,CO3,管中发生,13,CO,2,此时,CO,2,升至,400ppm,待其再次降到,200ppm,，将标记盆移走，放入另一光合室内一段时间，以便使呼出的,13,CO,2,被固定，使标记最大化。,35,3.Florian wechern, el at, 2007. Soil Biology,Biochemistry 39,2527-2537.,研究目的,：土壤根源性,C,和,N,的沉积及其归宿。,实验,：田间小区。,示踪剂,：,14,C-,蔗糖，,15,N-,尿。,标记方法：,茎部饲喂。标记溶液,1ml,浓度,2%(w/v),13,C,丰度为,99%,的蔗糖和浓度,0.5%(w/v),，,15,N,丰度为,99%,的尿素。引入方法,在距根部约,3cm,的茎处钻,0.5mm,的洞，用灯芯与盛标记溶液的带盖试管相连，用硅胶密封连接处。,36,示踪研究举例,14,CO,2,植物光合生理研究,目的,：,测量光合强度，同化物的运转与分配，运转机理，源与库的关系及其调节，研究作物高产的光合生理。,1,）,14,CO,2,标记,(,14,CO,2,+,12,CO,2,),的发生。,反应方程,(HClO,4,H,3,PO,4,),Ba,14,CO,3,+Na,2,CO,3,(,14,CO,2,+,12,CO,2,),37,有关计量参量,光合作用二氧化碳的饱浓度为（,0.12%-0.18%,），一般向光合作用室引入,0.1%,0.2%,浓度,最高不,0.5%,4,CO,2,的放射性浓度,(a ),：整株标记，,5,Ci/L,；标记单个器官，几百,kBq/L,；标记大型树木，,100,Ci/L,。,设光合作用室的体积为,V(L),二氧化碳的浓度为,C(%),则,所需载体,Na,2,CO,3,：,38,Na,2,CO,3,+2 HClO,4,CO,2,+2NaClO,4,+H,2,O,106 22.4,X V,C,所需,Ba,14,CO,3,的活度,A=V,a,发生过程：,在光合作用室内直接发生，或预先在实验室发生，标记时注射法引入。,39,2,）标记过程,光合室 用聚氯乙稀（框或不框）封围供试体，扎紧，保证气密，在袋上封扎进气软胶皮导管,。,用注射器定量吸取发生好的,(,14,CO,2,+,12,CO,2,）注入光合室，爆光,30min,后，抽出残气，用,NaOH,吸收。,40,41,3,）测样方法,固样,105,0,C,杀青,80,0,C,烘干，磨碎,.,取,100mg,，低本底计数或固闪杯法测量。,液样 用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量。,42,4,）结果分析,14,C,分配率,43,样品的采集和制备,采集,代表性,四分法缩减取样。,防止交叉污染,按活度由低到高顺序制备样品。,制备,把样品转化为适合测量与分析的形态,由析对,象和测量方式决定。,44,液闪样品的制备,均相 样品在闪烁液中形成溶液。,测量方式 非均相 乳浊液、悬浮液。,固体支持 样品吸附于滤膜再侵入闪,烁液。,均相样品制备法,1,）溶剂提取法,侵渍法 样品匀浆振荡提取离心过滤, 浓缩。,索氏抽提 用索氏器回流提取。,45,2,）消化法,酸消化,:,0.2,0.6ml 60%HClO,4,50,100mg,样品,0.2,0.4ml H,2,O,2,注意,14,C,有可能形成,14,CO,2,，该法淬灭较碱消化法的大。,碱消化,:,常用无机碱或季胺碱：,1ml 2M NaOH+80,100 mg,样品,2ml 1,1.5M,海胺甲醇液,+400-450mg,样品,46,3),燃烧法,14,CO,2,被碱性吸收液吸收,样品,T,2,O,吸收液配方：,甲苯,480 ml,乙氧基乙醇,400 ml,乙醇胺,120 ml,对,14,2,的回收率的,96-98%,PPO 6 g,POPOP 0.2 g,47,3),燃烧法,甲苯,800 ml,乙氧基乙醇,200 ml ,PPO 5 g,对,3,H,水的回收率为,96-98%,POPOP 0.2 g,乳化样品,：,使样品在闪烁体系中形成胶体或乳浊液。,700ml,甲苯,+300ml Tritonx100+PPO (5g)+POPOP (0.5g),固体支持,：,样品滴加或沉淀在滤膜,(,滤纸、玻璃纤维,、醋酸纤维,),，干燥后浸入闪烁液，相,对测量。,48,放射性测量数据的处理,1.,射性计数的统计涨落,由于核衰变受随机过程支配，在测量条件及源强不变条件下，放射性测量计数不是定值，而是围绕某一定值上下涨落的随机变数，在计数,N,100,时，其分布可用正态分布描述：,49,实例,样 品,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,N,i,(2min),1880,1887,1915,1851,1874,1853,1931,1866,1980,1893,样 品,11 12 13 14 15 16 17 18 19 20,N,i,(2min),1976,1876,1901,1979,1836,1832,1930,1917,1899,1890,50,1.,放射性计数的统计涨落,式中,M,和,分别是分布的数学,期望值和标准差，对于放射性,计数特别有, ，即只有,一个独立的统计特征量。,计数,N,出现在,M,区间,的概率：,51,2.,统计误差,由一次测量结果或有限次测量的平均值作为计数期望值的估计,所引起的误差,一般用标准差,N,表示：,结果表示为：,标准误差的统计意义,:,由正态分布知，任何一个计数落在,M,区间的概率,:,P(,N-M,),68.3%,反过来有,:,因此，标准误差表示,N,N,区间包含真平均值的概率为,68.3%,。,52,3.,函数统计误差的运算,函数,Z,f(x,y),的误差传递公式,53,3.,函数统计误差的运算,1),计数率 的误差,计算上列第一次测量,的计数率及误差。,解,:,54,3.,函数统计误差的运算,2),平均计数 的,误差,3),平均计数率 的误差,计算实例所列数据的平,均计数率及误差。,解,:,55,3.,函数统计误差的运算,3),平均计数率的误差,4),净计数率的误差，扣除本底的计率,56,3.3.2,稳定性,15,同位素示踪,示踪核素的丰度选择,以,15,肥料利用率试验为例,:,式中：,W,施肥量或产量，,N,含氮量,(%),，,a,原,子百分超，,R,肥料利用率，,f,、,p,肥料或植物,.,样品采集与制备,采集：,代表性和防止交叉污染。,57,制备：,将样品中的氮转变成,N,2,供质谱或光谱分析,15,丰度,.,1),凯氏,里屯伯格法,凯氏消煮,植物,0.3-0.5g,( 1-1.5 mg N ) +5-10 ml H,2,SO,4,土壤,1-2g,2,小时,清亮后，继续,5,小时,58,蒸馏定氮,在碱性条件，将氨蒸出并被硼酸吸收，然后用,H,2,SO,4,滴,定测量全,N,。,样品全,N,含量,式中,V,1,，,V,0,样品和对照消耗酸的体积,，,V,2,消煮液的,定容体积，,V,3,用于蒸馏定氮的消煮液体积。,59,过程,3ml 10M NaOH/ml,消煮液,部分,消煮液 定容 蒸馏,2% H,3,BO,4,（,+,指示剂,),吸收,滴定 酸化 浓缩,(2-3 ml),密封保存,里屯伯格转化,将铵转化成,N,2,，为防止大气中,N,2,的稀释在高真空装置,进行。,2NH,4,+,NaBrO+2OH,-,N,2,+5H,2,O,3NaB,r,60,15,样品制备,BUCHI,全自动凯氏定氮仪,61,2,）杜马法,(,光谱,),样品,N N,2,+(H,2,O,、,CO,2,被,CaO,吸收,),CO(NH,2,),2,+3CuO N,2,+CO,2,+2H,2,O+3Cu,2KNO,3,+5Cu,2,2,CuO,62,过程,固样,(,100 g N),+CuO+CaO,液样,(,派勒斯管,),放电管,(,18150),抽真空 焙烧,(,马福炉,),63,15,丰度的质谱测定,原理,N,2,按,( ),偏转分离,64,15,丰度的质谱测定,离子经加速电位,V,D,后的动,能,:,进入一垂直磁场后，在,劳伦兹力作用下做圆周运,动。,以上两式消去速度,v,得,:,质谱原理图,65,15,丰度的质谱测定,分析公式,:,因此，固定,R,和,B,，通过改变,V,D,(,电压扫描,),，就可在得到,质谱图。,MAT261,66,15,丰度的质谱测定,测定分析,N,2,分子构成概率，设原子是,14,N,的概率为,p,是,15,N,的为,q,，则有,:,15,N,丰度测定,当,a,5%,，,选,28,和,29,峰分析，定义：,显然,于是,67,测定分析,若,a,很高，采用,丰度适中时，,68,样品分析的计量关系,样品中的氮来自标记氮源的百分比,可由同位素稀释原理求出。,据同位素稀释定理有：,式中：,N,s,、,N,f,植物中来自土壤及肥料的氮素,a,p,、,a,f,植物及肥料样品的,15,N,原子百分超。,由上式，植物,N,素来自肥料的百分比,：,69,